液相雜交檢測B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞系miR28的表達(dá)

1、液相雜交檢測B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞系miR-28的表達(dá)【摘要】irRNA(iRNA)是一組在進(jìn)化上高度守舊、非編碼卵白、到場轉(zhuǎn)錄后調(diào)治的小分子RNA19-25核苷酸。為了進(jìn)一步明白iRNA的加工機(jī)制及成效和定量研究iRNA的表達(dá)程度，應(yīng)用液相雜交和Nrthernblt兩種要領(lǐng)檢測iR-28在B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞系中的表達(dá)并舉行了比力。效果表白：液相雜交和Nrthernblt檢測iR-28均顯出陽性效果，但液相雜交所用的細(xì)胞總RNA量5g顯著少于Nrthernblt30g，液相雜交的條帶信號(hào)也較Nrthernblt的強(qiáng)。結(jié)論：液相雜交是一種較Nrthernblt更為快速、輕便和敏感的檢測iR-28的要領(lǐng)。

2、【關(guān)鍵詞】淋巴瘤ExpressinfiR-28inBellLyphaellLinesDetetedbySlutinHybridizatinAbstratirRNA(iRNA)isevlutinarilynserved，nn-dingsallRNA(19-25nt)invlvedinpst-transriptinalgeneregulatin.TfurtherunderstandthebigenesisandfuntinsfiRNA，andtquantifyiRNAexpressinlevels，theexpressinfiR-28inBlyphaelllinesasdetetedbysluti

3、nhybridizatinandNrthernblt，andthEirdetetedresultserepared.TheresultsindiatedthatdetetinfiR-28byslutinhybridizatinandNrthernbltshedpsitive，butttalRNAauntusedfrslutinhybridizatindetetinassignifiantlylerthanthatfrNrthernbltdetetin(5gvs30g)，signalfslutinhybridizatinasstrngerthanthatfNrthernblt.Itisnlude

4、dthattheslutinhybridizatinfrdetetinfiR-28inBelllyphaelllinesisafasterandresensitiveethdasparedithstandardNrthernblttehnique.Keyrdsslutinhybridizatin;NrthernbiRNA;lypha;iR-28irRNA(iRNA)是一種巨細(xì)約19-25個(gè)堿基的單鏈小分子RNA，是由具有發(fā)夾布局的約70-90個(gè)堿基巨細(xì)的單鏈RNA前體顛末切酶dier加工后天生1。iRNA在線蟲、果蠅、小鼠和人等多個(gè)物種中被普及創(chuàng)造，并且在進(jìn)化上高度守舊，在人類已經(jīng)創(chuàng)造有222

5、個(gè)iRNA。如今對(duì)iRNA的研究不竭深化，并以為這些普及存在的小分子在真核基因表達(dá)調(diào)控中有著普及的作用。由于iRNA是一類很小的分子，它的表達(dá)程度大概很低，因此必要極為敏捷而定量的闡發(fā)東西。由于其分子很小，用RT-PR的要領(lǐng)來定量研究非常困難，如今研究職員多接納Nrthernblt要領(lǐng)來檢測iRNA的存在2。傳統(tǒng)的Nrthernblt要領(lǐng)是用探針檢測固相支持物膜上的目的分子，由于用探針檢測液相中的目的分子遠(yuǎn)比檢測固相中的目的更為敏捷，本研究接納液相雜交slutinhybridizatin的要領(lǐng)檢測4種B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞系中iR-28的表達(dá)。iR-28基因是22個(gè)堿基的單鏈小分子RNA，是由具有發(fā)

6、夾布局的86個(gè)堿基的單鏈RNA前體顛末切酶加工后天生，位于染色體3q27-28的含LI的脂肪瘤多見交融資伴LI-ntaininglipapreferredpartner，LPP基因中。質(zhì)料和要領(lǐng)細(xì)胞系B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞系HR57、RK8、BEVA和L-LY8，接納含10%胎牛血清的RPI1640造就液，于37、5%2及恒定濕度條件下造就。細(xì)胞總RNA的提取總RNA提取接納TRIzL試劑Lifetehnlgies公司舉行RNA一步法提齲取對(duì)數(shù)生恒久細(xì)胞1107，經(jīng)預(yù)冷的PBS洗滌，移入離心管中，參加1lTRIzL，混勻，室溫靜置15分鐘；參加0.2l氯仿，振蕩15秒，靜置3分鐘；4、12000g離

7、心15分鐘，取上清；參加0.5l異丙醇，將管中液體輕輕混勻，室溫靜置10分鐘；4、12000g離心10分鐘，棄上清；加1l75%乙醇，輕輕洗滌沉淀；4、7500g離心5分散，棄上清；風(fēng)干，參加適量的DEPH2溶解；-80保存?zhèn)溆谩NA定量獲得當(dāng)稀釋的RNA樣品，別離在紫外分光光度計(jì)260n和280n波長下讀數(shù)，按1D值40g/LRNA盤算RNA的含量。iR-28探針制備接納irVanaTiRNAPrbenstrutinKitAbin公司制備探針。iR-28的序列為：5AAGGAGUAAGUUAUUGAG3。方案iR-28探針為：在3端別的增長8個(gè)和T7啟動(dòng)子互補(bǔ)的堿基5TGTT3，將這段寡核

8、苷酸和T7啟動(dòng)子引物退火，用KlenDNA聚合酶，于37作用30分鐘，將大片斷補(bǔ)齊得到雙鏈DNA轉(zhuǎn)錄模版，然后與T7RNA聚合酶、rNTP和標(biāo)識(shí)表記標(biāo)幟物-32PUTP混淆，體外37作用30分鐘，轉(zhuǎn)錄得到標(biāo)識(shí)表記標(biāo)幟的小分子iR-28探針5GAGAAGGUAAUAGAUGUGAGUUU3；DNase于37，作用10分鐘消化多余的雙鏈DNA轉(zhuǎn)錄模版。詳細(xì)操縱參照產(chǎn)物說明書舉行。NrthernbltRNA電泳起首制備15%尿素變性聚丙烯酰胺凝膠，在離心管中混淆待測細(xì)胞系總RNA30g和加樣緩沖液5l，95-100變性3分鐘，立即置冰浴，加樣，恒流20A舉行電泳，分散分子量巨細(xì)差異的RNA。待溴酚藍(lán)

9、移至膠長的2/3時(shí)中斷電泳，紫外燈下不雅察RNA質(zhì)量。轉(zhuǎn)膜用半干轉(zhuǎn)移法sei-drytransfer將RNA從變性膠轉(zhuǎn)移到Hybnd尼龍膜上AershaBisienes公司200A，30分鐘，UV交聯(lián)。預(yù)雜交將膜的反面緊貼雜交瓶，參加雜交液AershaBisienes公司10l，42預(yù)雜交3小時(shí)。雜交將變性的同位素標(biāo)識(shí)表記標(biāo)幟的iR-28探針95-100變性5分鐘，冰浴5分鐘20l參加到雜交液中，42雜交4小時(shí)或留宿。洗膜傾去雜交液，用2SS/0.1%SDS/DEP水，42洗20分鐘，2次；再用1SS/0.1%SDS/DEP水，42洗20分鐘，2次。顯影用薄型塑料紙將膜包好，置于暗盒中，在暗室

10、中壓上X光片。暗盒置-80放射自顯影2-3天擺布檢測效果。液相雜交用irVanaTiRNADetetinKitAbin公司舉行，起首將同位素標(biāo)識(shí)表記標(biāo)幟的iR-28小分子探針舉行凝膠純化gelpurifiatin，然后與待檢測細(xì)胞系總RNA5g混淆，95-100變性3分鐘后于42雜交2小時(shí)或留宿?；诤嗣副幼o(hù)闡發(fā)要領(lǐng)，用單鏈核酸酶RNaseA/T1消化未雜交的RNA和多余的探針，于37作用1小時(shí)。然后用RNase/PPT溶液225l使核酸酶失活，并加等量的100%乙醇，于-20條件下，作用30分鐘沉淀雜交的RNA分子，4、12000g離心15分鐘，棄上清，風(fēng)干10分鐘，與加樣緩沖液5l混淆，9

11、5-100變性3分鐘，加樣于15%尿素變性聚丙烯酰胺凝膠，恒流20A電泳至待溴酚藍(lán)移至膠長的2/3時(shí)制止，用薄型塑料紙將凝膠包好，置于暗盒中，在暗室中壓上X光片。暗盒置-80放射自顯影1-2天檢測效果。詳細(xì)操縱參照產(chǎn)物說明書舉行。效果細(xì)胞總RNA提取用本要領(lǐng)所提取的細(xì)胞總RNA的D(260)/D(280)和D(260)/D(230)都在2.0擺布，說明RNA樣品未受到卵白質(zhì)、苯酚和碳水化合物的污染。RNA電泳時(shí)18S和28SrRNA的條帶清楚，無拖尾征象，說明RNA的純度和完備性都很好。iR-28探針制備用irVanaTiRNAPrbenstrutinKit制備的探針經(jīng)15%尿素變性聚丙烯酰胺

12、凝膠電泳后放射自顯影，在30個(gè)堿基處可見顯著清楚的條帶，說明探針標(biāo)識(shí)表記標(biāo)幟精良。Nrthernblt和液相雜交兩種要領(lǐng)檢測iR-28的效果比力從附圖中可以看出：iR-28在HR57、RK8、BEVA和L-LY8細(xì)胞系中的表達(dá)是不同等的。Nrthernblt和液相雜交兩種要領(lǐng)均檢出陽性效果；液相雜交所用細(xì)胞總RNA為5g，Nrthernblt為30g，而液相雜交效果條帶信號(hào)較更強(qiáng)，說明液相雜交檢測iR-28較Nrthernblt要領(lǐng)敏感。討論RNA一度被以為僅僅是DNA和卵白質(zhì)之間的“過渡階段，但越來越多的證據(jù)表白，RNA在生命的歷程中飾演的腳色遠(yuǎn)比我們先前假想的更為緊張。RNA滋擾RNAin

13、terferene的創(chuàng)造使得人們對(duì)RNA調(diào)控基因表達(dá)的成效有了全新的熟悉，更由于可以簡化或交換基因敲除而成為研究基因成效的有力東西，因此分外引人留意。iRNA是一種巨細(xì)19-25nt的單鏈小分子RNA，最早被確認(rèn)的iRNA是在線蟲中的lin-43和let-71，4，到如今為止已經(jīng)有快要1400個(gè)iRNA在包羅人類、果蠅、植物等多種生物物種中被報(bào)道。隨著對(duì)這些iRNA的基因序列、加工表達(dá)方法、生理成效等方面日益深化研究創(chuàng)造，iRNA發(fā)揮著非常緊張的基因表達(dá)調(diào)治作用，可以從一種全新的角度來熟悉基因及其表達(dá)調(diào)治的本質(zhì)。2002年美國?科學(xué)?雜志評(píng)出的年度十大科技打破中，iRNA的創(chuàng)造名列榜首。比年來

14、，iRNA在惡性疾病中的作用引起很大的存眷，以為iRNA在腫瘤發(fā)病中起緊張作用5。alin等6研究創(chuàng)造，50%以上的iRNA基因定位于與腫瘤相干的地區(qū)或脆性地區(qū)。在惡性淋巴增殖性疾病中，iRNA直接到場染色體的缺失，約莫50%的LL中有染色體13q14的缺失，iR-15和iR-16基因定位于染色體的13q14位置上，在慢性淋巴細(xì)胞白血病LL病人中創(chuàng)造這2個(gè)基因的表達(dá)有缺失或下調(diào)征象存在2。Eis等7研究創(chuàng)造，在一些B細(xì)胞淋巴瘤，包羅布滿性大B細(xì)胞淋巴瘤DLBL中iR-155的拷貝數(shù)較正常循環(huán)中B細(xì)胞高10-30倍?；罨疊細(xì)胞型DLBL的iR-155拷貝數(shù)顯著高于生發(fā)中央型DLBL，且前者具有較

15、差的預(yù)后，故以為iR-155的表達(dá)量可以作為B細(xì)胞淋巴瘤的診斷和預(yù)后指標(biāo)。alin等8運(yùn)用基因芯片技能對(duì)LL樣本中數(shù)百個(gè)iRNA前體和iRNA舉行檢測，按照效果將LL分為兩組，且與LL疾病狀態(tài)和ZAP-70的表達(dá)有關(guān)，以為iRNA的表達(dá)與此類白血病的生物學(xué)和臨床舉動(dòng)嚴(yán)密相干。由于iRNA大概到場分化9、發(fā)育10、構(gòu)造生長11、脂肪代謝12等生理歷程，在差異的構(gòu)造和發(fā)育階段的表達(dá)程度有所差異，進(jìn)一步相識(shí)iRNA的生物成效必要確定其在種種生物樣品中的表達(dá)程度，因此必要一種準(zhǔn)確的定量純化要領(lǐng)，以便得到可信的數(shù)據(jù)。隨著iRNA日益收受到研究職員的器重，許多研究iRNA的新要領(lǐng)不竭推出。iRNA探針的制

16、備要領(lǐng)比力簡樸，只必要預(yù)備目的基因的一小段寡核苷酸序列，3端別的增長8個(gè)和T7啟動(dòng)子互補(bǔ)的堿基，與T7啟動(dòng)子引物退火，用Klen聚合酶得到雙鏈的轉(zhuǎn)錄模板，然后用T7RNA聚合酶、rNTP和標(biāo)識(shí)表記標(biāo)幟物混淆，體外轉(zhuǎn)錄得到標(biāo)識(shí)表記標(biāo)幟的iRNA探針。這種要領(lǐng)可以快速制備種種標(biāo)識(shí)表記標(biāo)幟同位素、非放射性的小于100核苷酸的iRNA探針，實(shí)用于包羅液相雜交，Nrthernblt和原位雜交等種種要領(lǐng)檢測核內(nèi)小仁RNA(sallnulearRNA，snRNA)、小滋擾RNA(siRNA)、iRNA和RNA。非放射性標(biāo)識(shí)表記標(biāo)幟的探針還可以用于原位雜交研究iRNA大概RNA在構(gòu)造中的漫衍。本研究運(yùn)用的基于核酶庇護(hù)闡發(fā)的液相雜交要領(lǐng)，將同位素標(biāo)識(shí)表記標(biāo)幟好的iRNA探針和待檢測樣品舉行混淆雜交，未雜交的RNA和多余的探針用單鏈核酸酶消化，然后使核酸酶失活，雜交的RNA分子末了通過變性膠電泳放射自顯影檢測效果。此要領(lǐng)不單操縱簡樸快速，并且敏捷度極高可以半定量檢測少至10ng總RNA模板中的iRNA，大概說，可以檢測阿托摩爾attle即10-18l級(jí)的靶目的，敏捷度是Nrthernblt的100倍，還可以在同一個(gè)樣品中同時(shí)檢測多個(gè)iRNA和長的RNA模板，為從事iRNA實(shí)行研究帶來便利。別的，現(xiàn)行的RNA純化要領(lǐng)包羅有機(jī)溶劑抽提+乙醇沉淀，大概是接納