P53與肝癌的基因治療課件

1、53與肝癌的基因治療2011級研究生四班：許騰、莊步強、高慶強、 劉穩(wěn)順、江海波 2022/9/181肝癌機制抑癌基因p53p53基因與肝癌的基因治療存在的問題展望2022/9/182 肝癌概念：指肝細胞 或 肝內(nèi)膽管細胞 較常見的惡性腫瘤，發(fā)病率僅次于胃癌和食管癌 本病以4049歲為多，男女發(fā)病率之比為251 每年新增病例：50多萬 主要臨床表現(xiàn)：肝區(qū)疼痛、肝臟腫大、黃疸、肝硬化癥狀等 治療：手術(shù)、介入、放療、化療、生物和免疫治療等 5年病死率：超過95%發(fā)生的癌腫2022/9/183 機制 腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中，由于各種基因表達及其調(diào)控的變化，使細胞在信號轉(zhuǎn)導網(wǎng)絡(luò)上表現(xiàn)出與正常細胞的顯著差異

2、。正常細胞的一些信號轉(zhuǎn)導通路在腫瘤細胞中表現(xiàn)為過度活躍，而另一些信號轉(zhuǎn)導通路則被阻斷。這種細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導的異常干擾了細胞對增殖、分化、凋亡等多方面的自身調(diào)控，特別是造成細胞增殖和凋亡失控，成為腫瘤發(fā)病的重要分子基礎(chǔ)。 隨著分子生物學和免疫學技術(shù)的飛速發(fā)展，基因治療技術(shù)在腫瘤的治療中具有廣闊的前景?；蛑委煹姆绞接袃深?，一類為基因矯正與置換，即將缺陷基因的異常序列進行校正，對缺陷基因進行精確的原位修復；另一類為基因增補，不去除異常基因，而是通過外源基因的非定點整合，使其表達正常產(chǎn)物，從而補償缺陷基因的功能，達到治療目的的一種方法。2022/9/184 抑癌基因 抑癌基因的突變、缺失及失活在肝癌的

3、發(fā)生發(fā)展中起著關(guān)鍵性的作用。目前，新發(fā)現(xiàn)的抑癌基因?qū)映霾桓F，較常見的有p53、p16、Rb、BCL-XS等。隨著人們對肝癌發(fā)病機制的深人了解，越來越多的證據(jù)表明：p53基因的突變與失活和肝癌的發(fā)生發(fā)展有著密切聯(lián)系 。近年來，隨著手術(shù)、放療及生物治療等方法的研究進展，使腫瘤綜合治療水平有了明顯提高，尤其是腫瘤體外細胞和動物模型基因治療，逐漸從單純的基礎(chǔ)研究過渡到臨床研究和應(yīng)用。本文主要從p53在肝癌基因治療方面作一簡要介紹。 2022/9/185 DNA damagep53Cell growth arrestApoptosisp53 activation and accumulation2022

4、/9/187 細胞內(nèi)p53蛋白的濃度增加是其對DNA損傷的應(yīng)答。這種作用不依賴于基因轉(zhuǎn)錄而涉及轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控機制，與預先存在p53mRNA增加的翻譯有關(guān)。在整個基因表達調(diào)控中，轉(zhuǎn)錄后的機制是重要的，而且特別是可能比轉(zhuǎn)錄調(diào)控有更快的應(yīng)答。該過程涉及胞漿內(nèi)mRNA-蛋白質(zhì)的相互作用，但是p53濃度增加的精確機制是不清楚的。2022/9/188病毒法常用的病毒以逆轉(zhuǎn)錄病毒和腺病毒作載體，其中逆轉(zhuǎn)錄病毒載體只感染處于分裂期的細胞，如腫瘤細胞，而對高分化不分裂的細胞就不能實施基因轉(zhuǎn)移。腺病毒載體則對各期的細胞均可感染，所以目前腺病毒載體更常用作p53轉(zhuǎn)移的載體，腺病毒介導的p53基因治療已廣泛開展。202

5、2/9/1810 Rei-set M等通過實驗證實：腺病毒介導的基因轉(zhuǎn)移可有效地將p53基因?qū)四[瘤細胞中；以GFP為報告基因，觀察到了腺病毒對肝癌細胞BEL402 、HLE及HuH 7均有很高的轉(zhuǎn)染率，腺病毒能有效地將目的基因?qū)敫伟┘毎?中并高效表達。BIY2102腺病毒載體轉(zhuǎn)染后能顯著提高 p53突變的HIE和HUH27細胞對順鉑和絲列霉素2C的敏感性，增強了化療藥物對HIE和HUH27細胞的殺傷作用，這為以腺病毒為載體將目的基因?qū)烁伟┘毎峁┝饲疤?。有資料顯示：用野生型p53腺病毒載體經(jīng)肝動脈注射治療轉(zhuǎn)移性肝癌的臨床試驗 ，野生型p53基因?qū)烁伟┘毎校梢园l(fā)揮殺滅或抑制肝癌細胞生

6、長的作用 ，Terence 等以受體介導基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)介導野生型 p53轉(zhuǎn)染含突變 p53的肝癌細胞株，發(fā)現(xiàn)能明顯抑制瘤細胞的生長，通過表達wtp53重組腺病毒載體，將p53基因?qū)烁伟┘毎暌?PLE/PRE/ 5細胞，通過誘導其凋亡和細胞周期阻滯可抑制癌細胞的生長。2022/9/1811舉例方法：構(gòu)建含人p53、B7-1、GM-CSF和IL-2 4種目的基因的重組腺病毒載體，感染3種肝細胞癌細胞系和肝細胞系L02，運用ELISA、免疫組化、流式細胞儀等方法，檢測目的基因在肝癌細胞中的表達，和對肝癌細胞生長的抑制及誘導其凋亡的作用。結(jié)果：肝癌細胞對腺病毒高度易感，腺病毒多重感劑量為50(50

7、MOI)時，可使90%左右的肝細胞癌表達目的基因。除IL-2外，其他3個目的基因都能在肝癌細胞中高效表達。導入多基因后，肝癌細胞的生長受到一定程度的抑制，并誘導肝癌細胞發(fā)生凋亡； 而L02肝細胞的生長卻未受影響。結(jié)論：腺病毒載體是進行肝癌基因治療的理想載體，由一個腺病毒載體介導的多種目的基因，能在肝癌細胞系中高效表達，且能抑制肝癌細胞的生長和誘導其調(diào)亡。 -腺病毒介導多基因?qū)Ω伟┘毎L的影響 中國普外基礎(chǔ)與臨床雜志 2000年第6期第7卷 2022/9/1812舉例方法：將載有人野生型p53-cDNA的真核表達質(zhì)粒p53-pcDNA3，用陽離子脂質(zhì)體介導轉(zhuǎn)染人肝癌細胞系HepG2，用流式細胞

8、儀檢測p53-pcDNA3對HepG2細胞生長的影響。結(jié)果：通過觀察細胞生長曲線與流式細胞儀檢測細胞周期和細胞的凋亡指數(shù)發(fā)現(xiàn)，HepG2細胞生長受到明顯的抑制。結(jié)論：脂質(zhì)體介導的p53基因可在HepG2細胞中表達，且明顯抑制該細胞的生長。 -脂質(zhì)體介導的p53基因?qū)Ω伟┘毎L的抑制作用 免疫學雜志 2000年第5期第16卷 2022/9/1814PTD 融合蛋白系統(tǒng) PTD 融合蛋白系統(tǒng) ( protein transduetion domain ，PTD )是一個富含堿性氨基酸殘基的蛋白結(jié)構(gòu)域，PTD融合蛋白系統(tǒng)被認為是一種很有前途的運載工具。丁忠陽等成功構(gòu)建了含 p53基因的原核表達載體

9、 pTATHAp53 ，在大腸桿菌BI21(DE3)Lyss內(nèi)誘導表達并進行了純化。通過純化的 p53蛋白經(jīng)腹腔免疫 BALBc小鼠，制備高效價的抗血清，為應(yīng)用PTD p 5 3基因治療肝癌的實驗研究奠定了理論基礎(chǔ)。2022/9/1815 存在的問題 p53基因在治療人類惡性腫瘤基因治療中取得了一定的成績，但仍存在許多不足之處。缺乏高效的載體系統(tǒng)，目前被應(yīng)用的載體都存在自身局限性，而且病毒本身也可導致相應(yīng)的不良反應(yīng)。p53基因目的基因的持續(xù)表達。降低p53基因在宿主體內(nèi)的毒性和免疫原性是否會誘發(fā)原 癌基因以及病人的安全性 (如最小治療劑量、最 大毒性、耐受性及誘變性)等問題都有待進一步解決。2022/9/1817 展望 p53基因是一種理想的分子靶向肝癌治療基因之一 。通過人工轉(zhuǎn)導修補突變的p53基因，可恢復其抑癌功能，通過拯救突變型p53基因、轉(zhuǎn)染野生型p53基因的方法治療肝癌不失為一種理想的治療方法，但還需要更進一步的研究尋找更高轉(zhuǎn)染率的載體、