ERΔE5在乳腺癌組織中的表達及臨床意義探討

1、ERE5在乳腺癌組織中的表達及臨床意義討論【摘要】目的：通過檢測乳腺癌和癌旁乳腺組織乳腺癌標本邊緣外5中雌激素受體EstrgenReeptr，ER剪切變異體ERE5表達程度的差異，討論ERE5在乳腺癌組織中的表達及臨床意義。方法：培養(yǎng)乳腺癌細胞株ZR-75-1，采用RT-PR檢測目的基因ERE5，建立陽性對照體系。以液氮冷凍儲存的59例乳腺癌組織和59例癌旁乳腺組織提取目的基因，進展對照實驗，檢測ERE5在乳腺癌組織和癌旁乳腺組織中的表達狀況，分析二者的表達差異及其臨床意義。結(jié)果：在ER陽性乳腺癌標本中，ERE5陽性20例20/44，ER陰性的乳腺癌標本中，ERE5陽性6例6/15，兩者差異無

2、統(tǒng)計學意義P=0.7170；在人表皮生長因子受體2huanepideralgrthfatrreeptr，HER-2陽性的乳腺癌標本中，ERE5陽性20例20/22,HER-2陰性的乳腺癌標本中，ERE5陽性6例6/37。采用單因素分析，發(fā)現(xiàn)乳腺癌標本中ERE5的陽性表達與HER-2的陽性表達呈正相關(guān)P0.0001。在乳腺癌標本中ERE5的陽性表達率為44.07%(26/59)；在癌旁乳腺組織中未見ERE5的表達，兩者比擬差異有統(tǒng)計學意義P0.0001。在乳腺癌標本中ERE5的表達與臨床分期無相關(guān)性P=0.9084。結(jié)論：在乳腺癌標本中ERE5的表達顯著高于癌旁乳腺組織，而且與HER-2表達呈正

3、相關(guān)，提示ERE5可能是一種新的臨床預后的指標?！娟P(guān)鍵詞】乳腺腫瘤受體，雌激素ERE5人表皮生長因子受體【ABSTRAT】bjetive：TevaluatetheptentialrelatinshipbeteenERE5andthepathphysilgiarkersfbreastarinabydetetingtheexpressinfestrgenreeptr(ER)spliingvariantERE5inthearinatusspeienanditsparaarinatusbreasttissue.ethds：TheexpressinfERE5inbreastarinatustissuea

4、nditsparaarinatusbreasttissuein59patientsfbreastanerasdetetedrespetivelybyreversetransriptinplyerasehainreatin(RT-PR).TheRT-PRaplifiatinfERE5fbreastanerellline乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一,內(nèi)分泌治療作為綜合治療的重要組成局部已愈來愈受到重視。1986年發(fā)現(xiàn)了第一個雌激素受體EstrgenReeptr，ER，隨著對其功能認識的深化，業(yè)已將乳腺癌分為兩大類：激素依賴型和激素非依賴型。目前認為在乳腺癌發(fā)生的早期，腫瘤細胞表現(xiàn)為激素依賴性生

5、長，因此可以使用激素拮抗劑進展治療,但腫瘤細胞會逐漸演變?yōu)榧に胤且蕾囆陨L，產(chǎn)生這種變化的分子機制目前仍不清楚。隨著RT-PR技術(shù)和RNA酶抑制劑的使用,1991年前后已在RNA程度發(fā)現(xiàn)了20余種ER的剪切變異體,被認為是乳腺癌激素非依賴性生長的一個可能因素。在這些剪切變異體中，ERE5是少數(shù)幾種功能域陽性的變異體之一。本研究旨在通過檢測乳腺癌組織和癌旁乳腺組織中ER剪切變異體ERE5的表達，討論ERE5在乳腺癌臨床診治中的意義。1資料與方法1.1一般資料搜集我科乳腺中心2022年410月間收治的乳腺癌患者59例，均為女性，年齡3178歲，平均年齡53歲。均行乳腺癌切除術(shù)，以乳腺癌組織為實驗組

6、，取腫瘤邊緣外5的癌旁乳腺組織作為對照組。所有標本均經(jīng)病理科醫(yī)師確診后，立即存放于液氮中冷凍儲存自取材到冷凍儲存的時間控制在30in內(nèi)，直至實驗中開場使用。59例乳腺癌標本中ER陽性44例，ER陰性15例，HER-2陽性22例，HER-2陰性37例；臨床分期：期19例，期26例，期10例，期1例，未分期3例；病理類型包括浸潤性小葉癌1例，黏液癌2例，導管原位癌2例，混合癌10例其中浸潤性導管癌并浸潤性小葉癌6例，浸潤性導管癌并黏液癌4例，浸潤性導管癌44例。1.2主要試劑與儀器人乳腺導管上皮癌細胞株ZR-75-1購自中國醫(yī)學科學院根底所；RT-PR引物由北京奧科生物技術(shù)有限責任公司合成；Sup

7、erSriptTFirst-StrandSynthesisSystefrRT-PR購自Invitrgen公司；Taq酶、RNA提取劑Trizl購自Prega公司；RPI1640購自GIB公司。主要儀器包括倒置顯微鏡LYPUS,日本、酶標儀Bi-Rad，日本、紫外分光光度儀PharaiaBiteh，英國、臺式高速離心機HERAEUS,德國、凝膠成像分析儀Bi-Rad，日本、恒溫恒流電泳儀北京東方儀器廠、水浴搖床EYELA,日本、2培養(yǎng)箱NAP，法國等。1.3實驗方法1.3.1細胞培養(yǎng)以RPI1640液為培養(yǎng)基含2l/L谷氨酰胺，10%FBS，100U/L青霉素鈉，100U/L鏈霉素，于37、5%

8、2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)ZR-75-1細胞株。當細胞鋪滿瓶時棄去細胞培養(yǎng)液，經(jīng)適當?shù)奶幚砗蟛捎肞rega公司的RNA提取液Trizl提取細胞總RNA。1.3.2檢測RNA質(zhì)量取細胞總RNA樣品30g，經(jīng)適當處置后于65變性15in，同時制備1%的瓊脂糖甲醛變性凝膠含1PS，2.2l/L的甲醛，預電泳5in，以1PS為電泳緩沖液，加樣后以35V/恒壓電泳，檢測RNA的質(zhì)量圖1。1.3.3RT反響將提取的總RNA5g在總體積為20L的反響體系中，用SuperSriptRT進展逆轉(zhuǎn)錄反響。65變性5in，4冷卻3in，42參加逆轉(zhuǎn)錄酶后反響52in，72滅活逆轉(zhuǎn)錄酶15in，4保存。1.3.4PRERE5上游

9、引物：5TGTATATGGAGAAG3，下游引物：5ATTTTTGGTTTGGA3；內(nèi)參上游引物：5AAGGTGAGAAGGGAAGTTGTATAAT3，下游引物：5TTGTTAGTAGGGATGATTG3。PR總體積為50L，RT反響產(chǎn)物為8L，內(nèi)參基因GAPDH的PR反響溫度及時間設(shè)定如下：94變性5in；94變性30s，55退火45s，72延伸90s，共30個循環(huán)；然后72延長7in，4保存。目的基因ERE5的PR溫度及時間設(shè)定如下：94變性5in；94變性30s，65退火90s，72延伸2in共40個循環(huán)；然后72延長15in，4保存。1.3.5PR的反響產(chǎn)物電泳及基因測序PR的反響產(chǎn)

10、物分別經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳GAPDH和2%瓊脂糖凝膠電泳ERE5檢測特異基因條帶，于凝膠成像分析系統(tǒng)中進展拍照，檢測目的基因是否表達。PR反響產(chǎn)物經(jīng)低熔點瓊脂糖凝膠電泳回收純化后，送上?？】粕锛夹g(shù)測序，將測序的結(jié)果與的人ERE5序列做Blast分析。以上細胞反響的過程作為實驗體系的陽性對照。1.4乳腺標本目的基因檢測乳腺癌標本及癌旁對照標本在液氮冷凍狀態(tài)下研磨后，將組織粉末放入無RNA酶的離心管中，按50g組織1Trizl將研磨后的組織和Trizl混合并用勻漿機制備勻漿。余實驗步驟同細胞實驗局部。1.5統(tǒng)計學分析用STATAversin8.0統(tǒng)計軟件進展數(shù)據(jù)處理。每組數(shù)據(jù)均采用2檢驗，可信區(qū)

11、間I為95%，P0.05為差異有統(tǒng)計學意義。2結(jié)果本研究所有標本提取的RNA經(jīng)過1%的瓊脂糖甲醛變性凝膠電泳檢測合格后進展目的基因的檢測。ZR-75-1細胞株及局部乳腺癌組織中檢測到含有730bp的目的基因ERE5，含500bp的內(nèi)參基因GAPDH均陽性表達圖在ER陽性乳腺癌標本中ERE5陽性率為.20/44，ER陰性的乳腺癌標本中ERE5陽性率為40.06/15，兩者差異無統(tǒng)計學意義P=0.7170；HER-2陽性的乳腺癌標本中，ERE5陽性率為90.9%20/22，HER-2陰性的乳腺癌標本中ERE5陽性率為16.2%6/37；采用單因素分析，乳腺癌標本中ERE5的陽性表達與HER-2的陽

12、性表達成正相關(guān)(P0.0001，表1)。在乳腺癌標本中ERE5的陽性表達率為44.07%(26/59)，在癌旁乳腺組織中未見ERE5的表達，兩者差異有統(tǒng)計學意義(P0.0001)。在3例未分期乳腺癌標本中，ERE5陽性2例；在19例期乳腺癌標本中，ERE5陽性8例；在26例期乳腺癌標本中，ERE5陽性12例；在10例期乳腺癌標本中，ERE5陽性3例；1例期乳腺癌標本陽性表達ERE5，臨床分期與ERE5的表達無統(tǒng)計學意義P=0.9048。轉(zhuǎn)貼于論文聯(lián)盟.ll.3討論年ER基因首次被發(fā)現(xiàn)3，其功能和臨床意義受到醫(yī)學界的關(guān)注。目前發(fā)現(xiàn)約60%的乳腺癌患者ER陽性。諸多臨床研究結(jié)果顯示，ER是乳腺癌獨

13、立的預后因素，而且可以用來指導內(nèi)分泌治療4。1991年前后人們相繼發(fā)現(xiàn)了數(shù)十種ER剪切變異體,但是這些變異體在乳腺腫瘤的發(fā)生、開展過程中所起的作用及其與乳腺癌預后的關(guān)系尚不明確5-6。有研究說明，ERE5在癌旁乳腺組織及腫瘤組織中均有表達，但在癌旁組織中表達量顯著低于腫瘤組織7。但本研究只發(fā)現(xiàn)腫瘤組織中.26/59表達730bp的ERE5，而癌旁組織中那么沒有表達。Indra等8研究發(fā)現(xiàn)不同人種中ERE5的表達狀況亦不同，如在高加索白人女性正常乳腺組織和腫瘤組織中都不曾發(fā)現(xiàn)ERE5的表達；而在非裔黑人美國女性的腫瘤組織和正常乳腺組織中均可以發(fā)現(xiàn)3種ERE5，分別為730bp、540bp和420

14、bp。因此推測，研究結(jié)果可能與人種有關(guān)，尚需大樣本臨床研究驗證。ERE5已發(fā)現(xiàn)十余年，是一種功能域陽性的ER剪切變異體，體外實驗中發(fā)現(xiàn)ERE5可以發(fā)生二聚化，在不依賴雌激素的情況下激活目的基因9-10，因此有學者認為它可能在乳腺癌由激素依賴型向激素非依賴型轉(zhuǎn)換過程中發(fā)揮了重要作用11。雖然ERE5無配體結(jié)合區(qū)，但它仍具備激活轉(zhuǎn)錄的功能，通過與ER競爭SR-1e抑制ER對基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)12-13。此外，等發(fā)如今ER陽性的乳腺癌細胞系中轉(zhuǎn)染ERE5后細胞對他莫昔芬耐藥。本研究證實在乳腺癌組織中ERE5的表達顯著增加，這種變化可能通過不同途徑改變雌激素對乳腺組織的調(diào)控，進而改變?nèi)橄侔┗颊邔Υ萍に厥荏w

15、拮抗劑和其他治療的反響。關(guān)于ERE5與乳腺癌預后關(guān)系的研究報道較少，Indra等8研究發(fā)現(xiàn)非裔美國女性與高加索白人女性乳腺癌患者相比預后差，基因程度檢測發(fā)現(xiàn)非裔黑人美國女性乳腺癌患者中ERE5的表達顯著高于高加索白人女性乳腺癌患者，因此考慮ERE5的異常表達可能與兩類患者預后不同有相關(guān)性。本研究未發(fā)現(xiàn)目的基因的表達與臨床分期有相關(guān)性，但經(jīng)單因素分析發(fā)現(xiàn)，ERE5的表達與HER-2的表達呈顯著正相關(guān)P0.0001。2000年，AS發(fā)表了新的乳腺癌、結(jié)直腸癌腫瘤標記物使用綱要，文中明確指出，HER-2為乳腺癌的腫瘤標記物之一6。目前認為，乳腺癌組織中HER-2的陽性表達與腫瘤分化差、淋巴結(jié)陽性呈正

16、相關(guān)15；HER-2陽性的乳腺癌患者對他莫昔芬治療的反響差。本研究發(fā)現(xiàn)HER-2的表達與目的基因的表達顯著相關(guān)，提示ERE5可能是一種可以預測乳腺癌預后和選擇內(nèi)分泌治療的新指標?！緟⒖嘉墨I】1larkeR,LippanE.Antiestrgenresistane：ehanissandreversalJ.DrugResistaneinnlgy,1992，501-536.2PfefferU,FearttaE,VidaliG.expressinfultipleestrgenreeptrvariantessengerRNAsinnralandneplastibreasttissueandinF-7el

17、lsJ.anerResearh,1995,5510:2158-2165.3GreeneGL,GilnaP,aterfield,etal.SequeneandexpressinfhuanestrgenreeptrpleentaryDNAJ.Siene(ashingtnD),1986,231(4742)：1150-1154.4ahudRk,TyF,HeingJ,etal.Lng-terpatternfdiseasereurreneangpatientsithearly-stagebreastanerardingtestrgenreeptrstatusandusefadjuvanttaxifenJ.

18、BreastanerResearhandTreatent,2022,107(1):71-78.5AnandappaSY,SibsnR,Platt-HigginsA,etal.VariantestrgenreeptrRNAsinhuanbreastanerspeiensJ.Internatinaljurnalfaner,2000,88(2)：209-216.6BastR,RavdinJP,HayesDF,etal.2000UpdatefReendatinsfrtheUsefTurarkersinBreastandlretalaner：linialPratieGuidelinesftheAeria

19、nSietyflinialnlgyJ.Jurnalflinialnlgy,2001,19(6):1865-1878.7LeygueER,atsnPH,urphyL.EstrgenreeptrvariantsinnralhuanaarytissueJ.JurnalftheNatinalanerInstitute,1996,88(5):284-290.8PlaI,larkeR,DeittyR,etal.FuntinallyativeestrgenreeptrisfrprfilesinthebreasttursfAfrianAerianenaredifferentfrtheprfilesinbrea

20、sttursfauasianenJ.aner,2002,94(3):615-623.9BlligA,iksiekRJ.Anestrgenreeptr-spliingvariantediatesbthpsitiveandnegativeeffetsngenetransriptinJ.leularEndrinlgy,2000,14(5)：634-649.10hlssnH,LykkesfeldtAE,adsen,etal.Theestrgenreeptrvariantlakingexn5hasdinantnegativeativityinthehuanbreastepithelialelllineHT-3522S1J.anerResearh,1998,58(19)：4264-4268.11FuquaSA,AllredD,ElledgeR,etal.TheER-psitive/PgR-negativebreastanerphentypeisntassiatedithutatinsithintheDNAbindingdainJ.BreastanerResearhandtreatent,