熒光法測(cè)定醛糖還原酶活性的優(yōu)化

1、熒光法測(cè)定醛糖復(fù)原酶活性的優(yōu)化【摘要】目的找出優(yōu)化NADP生成熒光法測(cè)定紅細(xì)胞醛糖復(fù)原酶(AR)活性的方案。方法通過研究血紅蛋白濃度、激發(fā)熒光水浴時(shí)間以及NADP溶液貯存時(shí)間對(duì)熒光強(qiáng)度的影響，優(yōu)化紅細(xì)胞AR活性測(cè)定的NADP生成法；以此方法測(cè)定正常及糖尿病大鼠AR活性。結(jié)果NADP生成法的準(zhǔn)確度受血紅蛋白影響，在終止反響后的NADP溶液中參加250l6高氯酸沉淀血紅蛋白可消除此影響；水浴激發(fā)熒光時(shí)間5、30、60in，熒光值變異系數(shù)無差異；在激發(fā)熒光前將反響體系生成的NADP溶液貯存于-20的條件下至少可以穩(wěn)定保存4。糖尿病大鼠AR活性明顯高于正常對(duì)照組(P0.05)。結(jié)論優(yōu)化的NADP生成法

2、可以更準(zhǔn)確測(cè)定紅細(xì)胞AR活性。【關(guān)鍵詞】糖尿?。蝗┨菑?fù)原酶；熒光；活性【Keyrds】Diabetes;Aldseredutase;Fluresene；Ativity1材料與方法1.1動(dòng)物及分組雄性10周齡SD大鼠20只，由中南大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，隨機(jī)分成2組：對(duì)照組和糖尿病組。1.2方法1.2.1試劑和儀器1.2.2大鼠糖尿病模型的復(fù)制大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3d，禁食12h，糖尿病組按5.5l/kg體重單次腹腔注射STZ溶液(STZ用0.1l/LpH4.2的檸檬酸緩沖液配成10g/l的溶液)，3d后尾靜脈采血隨機(jī)測(cè)血糖13.5l/L者為糖尿病大鼠，對(duì)照組注射等量檸檬酸緩沖液。飼養(yǎng)期間所有大鼠自由飲

3、水進(jìn)食。4后眼眶采血，血糖儀測(cè)定血糖。1.2.3制備裂解紅細(xì)胞4后，眼眶采血，取肝素抗凝血1l，3000r/in10in別離紅細(xì)胞，然后加4倍體積4預(yù)冷的生理鹽水，3000r/in10in3次離心洗滌紅細(xì)胞，按照50l/支分裝(一支實(shí)驗(yàn)管，其余備用)，-20凍存。取凍存紅細(xì)胞加200l10l/L磷酸鉀緩沖液(pH6.0)，振蕩溶解10in，3000r/in10in，去沉淀。1.2.5終止反響5in后，將樣本同時(shí)放入冰浴中，參加600l0.5l/LHl后60水浴15in來終止反響并破壞反響剩余的NADPH。冰浴冷卻后參加250l6高氯酸3000r/in10in離心沉淀血紅蛋白，汲取上清1l，-2

4、0凍存。1.2.6熒光值測(cè)定參加2l6l/LNaH(內(nèi)含10l/L咪唑)37水浴5in激發(fā)NADP產(chǎn)生熒光，Ex360n/E460n測(cè)定熒光強(qiáng)度。1.2.7血紅蛋白含量測(cè)定6用高鐵氰化血紅蛋白法。實(shí)驗(yàn)管加稀釋液3l，紅細(xì)胞溶血液12l，空白管以去離子水代替紅細(xì)胞溶血液，混勻，靜置5in，以空白管調(diào)零測(cè)實(shí)驗(yàn)管在540n的吸光度值，計(jì)算血紅蛋白含量Hb(g/L)D540367.7。每份樣品平行做三份取均值。1.2.8繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算AR活性反響體系與條件同上，去離子水代替紅細(xì)胞溶血液，NADP(01000l/L)代替NADPH，以NADP濃度為橫坐標(biāo)，熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)做標(biāo)準(zhǔn)曲線，求回歸方程。由方

5、程求得NADP生成量，以每分鐘產(chǎn)生1lNADP為1個(gè)酶活性單位(U)，計(jì)算AR活性。1.2.9血紅蛋白對(duì)AR活性測(cè)量值的影響按照以上實(shí)驗(yàn)方法分別測(cè)定在參加2.5、4、5、6、10l同一紅細(xì)胞溶血液的情況下激發(fā)的熒光強(qiáng)度；在終止反響后的NADP溶液中未參加250l6高氯酸沉淀血紅蛋白，然后測(cè)定激發(fā)的熒光強(qiáng)度。轉(zhuǎn)貼于論文聯(lián)盟.ll.1.2.10樣本的保存周期以同一溶血液為標(biāo)本，測(cè)定反響體系生成的NADP溶液在-20凍存0、4、24h，1、2、4后的NADP激發(fā)的熒光強(qiáng)度。1.2.11同一紅細(xì)胞溶血液激發(fā)熒光的水浴反響時(shí)間對(duì)熒光強(qiáng)度的影響37水浴5in后測(cè)量NADP產(chǎn)生的熒光值；37水浴30in后測(cè)

6、量NADP產(chǎn)生的熒光值；37水浴60in后測(cè)量NADP產(chǎn)生的熒光值。1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果用xs表示，兩樣本均數(shù)比擬用t檢驗(yàn)，多樣本均數(shù)比擬(成組設(shè)計(jì))用單因素方差分析。統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)軟件包。2結(jié)果2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線與回歸方程N(yùn)ADP標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程：熒光強(qiáng)度=2.828+1.419NADP濃度，那么NADP濃度=(熒光強(qiáng)度-2.828)/1.419。2.2血紅蛋白對(duì)AR活性測(cè)量值的影響在未去除血紅蛋白的條件下，紅細(xì)胞溶血液在2.510l的范圍，熒光強(qiáng)度隨紅細(xì)胞血紅蛋白量的增加而降低；在終止反響后的NADP溶液中參加250l6高氯酸沉淀血紅蛋白，熒光強(qiáng)度隨紅細(xì)胞溶血液的含量升

7、高而升高，提示紅細(xì)胞對(duì)熒光測(cè)量值有較大干擾。紅細(xì)胞溶血液2.5、4、5、6、10l各組未去除血紅蛋白測(cè)定的熒光值均低于去除血紅蛋白測(cè)定的熒光值(P0.05)，見表1。表1紅細(xì)胞溶血液在去除和未去除血紅蛋白條件下激發(fā)的熒光強(qiáng)度(略)2.3樣本的保存周期-20凍存4、24h，1、2、4后的NADP溶液測(cè)定的熒光強(qiáng)度分別是：45.21.7，44.21.3，45.41.9，44.12.1，44.42.3與對(duì)照組(44.91.2)比擬差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。2.4激發(fā)熒光的水浴反響時(shí)間對(duì)熒光強(qiáng)度的影響生成的NADP溶液參加含咪唑的NaH后，在37水浴分別放置5、30、60in激發(fā)熒光值，各組間總

8、體均數(shù)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)，各組間變異系數(shù)的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)，見表2。表2激發(fā)熒光的不同水浴時(shí)間測(cè)量的熒光強(qiáng)度(略)2.5各組大鼠血糖和紅細(xì)胞AR活性比擬糖尿病大鼠造模4后血糖為(22.723.42)l/L與對(duì)照組血糖(6.251.04)l/L比擬顯著升高P0.05。糖尿病大鼠AR活性(5.642.28)U/g較對(duì)照組(1.450.98)U/g顯著升高P0.05。3討論反響體系生成的NADP溶液是否能長(zhǎng)期保存目前未見報(bào)道，我們的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，NADP溶液經(jīng)過4、24h、1、2、4的貯存時(shí)間后激發(fā)熒光強(qiáng)度無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。建議實(shí)驗(yàn)可以分段進(jìn)展，以進(jìn)步效率，特別合適需要在別處使用熒光分光光度計(jì)的實(shí)驗(yàn)室。目前測(cè)定紅細(xì)胞AR活性的方法中，激發(fā)熒光的水浴反響時(shí)間主要有5、30、60in。結(jié)果顯示，37水浴5in熒光強(qiáng)度已接近最大值，560in激發(fā)的熒光值逐漸增大。530in比3060inAR活性