高山紅景天葉肉原生質(zhì)體分離培養(yǎng)與植株再生

1、高山紅景天葉肉原生質(zhì)體分離培養(yǎng)與植株再生2022/9/81第1頁(yè)，共24頁(yè)，2022年，5月20日，20點(diǎn)22分，星期四目的：利用高山紅景天組培苗葉片分離得到原生質(zhì)體，經(jīng)培養(yǎng)后獲得再生植株。方法：研究外植體前期預(yù)處理、外植體的大小、酶液配比、酶液中甘露醇濃度等影響原生質(zhì)體的相關(guān)因素，確定最優(yōu)條件。2022/9/82第2頁(yè)，共24頁(yè)，2022年，5月20日，20點(diǎn)22分，星期四 高山紅景天2022/9/83第3頁(yè)，共24頁(yè)，2022年，5月20日，20點(diǎn)22分，星期四高山紅景天人工栽培利用的研究高山紅景天2022/9/84第4頁(yè)，共24頁(yè)，2022年，5月20日，20點(diǎn)22分，星期四高山紅景天：

2、為景天科紅景天屬多年生草本植物，是長(zhǎng)白山珍稀藥用植物之一，具有抗缺氧、抗寒冷、抗疲勞、抗微波輻射等顯著功能。2022/9/85第5頁(yè)，共24頁(yè)，2022年，5月20日，20點(diǎn)22分，星期四 一 材料和方法 1.材料 高山紅景天組 培苗葉片2022/9/86第6頁(yè)，共24頁(yè)，2022年，5月20日，20點(diǎn)22分，星期四2. 原生質(zhì)體分離：取材：幼嫩葉片(長(zhǎng) 0.53 ）切成寬1.02.0 mm 的條狀酶液配制：0.5 %2 %纖維素酶 + 0.3 %1 %果膠酶 + 10 mmol/ L CaCl2 2H2O + 0.1 %MES + 0.7 mmol/ L KH2 PO4 + 0.40.6mo

3、l/ L 甘露醇, p H = 5.8酶解處理：以1 10 的量將材料放入酶液。于25 ,黑暗條件下振蕩酶解15h ,轉(zhuǎn)速為80 r/ min 。2022/9/87第7頁(yè)，共24頁(yè)，2022年，5月20日，20點(diǎn)22分，星期四3.原生質(zhì)體純化：酶解后的原生質(zhì)體和酶混合液經(jīng)250 目的尼龍網(wǎng)濾過(guò)后以800 r/ min 離心8min 沉降原生質(zhì)體。向沉降的原生質(zhì)體中再加入洗滌液和液體培養(yǎng)基各清洗1 次備用。洗滌液：10mmol/ L CaCl2 2H2O + 0.1 % MES + 0.7mmol/ LKH2 PO4 + 0.4 mol/ L 甘露醇, p H = 5.8液體培養(yǎng)基：1/ 2MS

4、 + 1 mg/ L 2 ,42D + 0.5 mg/ L ZT + 0.5 mol/ L 甘露醇 + 5 00 mg/ L 水解酪蛋白。2022/9/88第8頁(yè)，共24頁(yè)，2022年，5月20日，20點(diǎn)22分，星期四4. 原生質(zhì)體存活率及產(chǎn)量的測(cè)定：活力測(cè)定:采用EvansBlue 染色法，存活率= (未染藍(lán)細(xì)胞數(shù)/ 細(xì)胞總數(shù)) 100 %。 原生質(zhì)體產(chǎn)量:用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行計(jì)數(shù),以每克鮮質(zhì)量組織獲得的原生質(zhì)體個(gè)數(shù)(個(gè)/ g) 來(lái)表示.2022/9/89第9頁(yè)，共24頁(yè)，2022年，5月20日，20點(diǎn)22分，星期四5. 原生質(zhì)體培養(yǎng)：將原生質(zhì)體密度調(diào)到210 105 個(gè)/ mL , 轉(zhuǎn)入原生質(zhì)

5、體液體培養(yǎng)基中進(jìn)行液體淺層黑暗靜置培養(yǎng)。在培養(yǎng)過(guò)程中每10 d 以3 1(原生質(zhì)體培養(yǎng)基無(wú)滲透壓調(diào)節(jié)劑培養(yǎng)基) 比例加入無(wú)滲透壓調(diào)節(jié)劑培養(yǎng)基,逐步降低滲透壓。2022/9/810第10頁(yè)，共24頁(yè)，2022年，5月20日，20點(diǎn)22分，星期四6.愈傷培養(yǎng)與植株再生: 當(dāng)多細(xì)胞團(tuán)進(jìn)一步增大,形成肉眼可見(jiàn)的小愈傷組織時(shí),挑出并轉(zhuǎn)移到愈傷組織培養(yǎng)基MS + 6-BA 2 mg/ L + NAA 0.5 mg/L ,轉(zhuǎn)為光照培養(yǎng)之前,首先經(jīng)過(guò)23 d 的弱光培養(yǎng)鍛煉階段,然后轉(zhuǎn)入光照培養(yǎng),繼續(xù)培養(yǎng)約1 個(gè)月時(shí)間。 經(jīng)3 次繼代培養(yǎng)后,挑選鮮綠色愈傷組織轉(zhuǎn)入芽分化培養(yǎng)基MS + 1 mg/ L 6-BA

6、 + 0.1 mg/ L NAA ,待小芽長(zhǎng)至2.0 cm 左右,切下轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基上形成完整植株,生根培養(yǎng)基為1/ 2MS。培養(yǎng)基p H = 5.8-6.0 ,瓊脂6 g/ L ,蔗糖25 g/ L ,在1.2 kg/ cm2壓力下滅菌20 min ,培養(yǎng)溫度(25 2) ,光照強(qiáng)度為2 0003 000 lx ,每天光照12 h 。2022/9/811第11頁(yè)，共24頁(yè)，2022年，5月20日，20點(diǎn)22分，星期四 二、結(jié)果與分析影響天原生質(zhì)體分離的因素光葉片大小酶類組合2022/9/812第12頁(yè)，共24頁(yè)，2022年，5月20日，20點(diǎn)22分，星期四1.光照與黑暗2022/9/813第

7、13頁(yè)，共24頁(yè)，2022年，5月20日，20點(diǎn)22分，星期四結(jié)果表明：在相同酶解條件下，光照與黑暗處理對(duì)高山紅景天原生質(zhì)體產(chǎn)量間差異不顯著，因此，在進(jìn)行原生質(zhì)體分離以前，對(duì)組培苗是否光照不是影響原生質(zhì)體產(chǎn)量的關(guān)鍵因素。在此實(shí)驗(yàn)中，直接采取沒(méi)有進(jìn)行黑暗預(yù)培養(yǎng)的組培苗進(jìn)行原生質(zhì)體分離。2022/9/814第14頁(yè)，共24頁(yè)，2022年，5月20日，20點(diǎn)22分，星期四2.葉片大小2022/9/815第15頁(yè)，共24頁(yè)，2022年，5月20日，20點(diǎn)22分，星期四在相同酶解條件下，長(zhǎng)度大于1.5cm的葉片原生質(zhì)體產(chǎn)量顯著高于長(zhǎng)度小于1.5cm的處理，因此，選用長(zhǎng)度大于1.5cm的葉片為宜。2022

8、/9/816第16頁(yè)，共24頁(yè)，2022年，5月20日，20點(diǎn)22分，星期四3.酶類組合 纖維素酶與果膠酶組合2022/9/817第17頁(yè)，共24頁(yè)，2022年，5月20日，20點(diǎn)22分，星期四 各處理存活率大小順序?yàn)?1 4 5 2 7 3 8 6 9 各處理產(chǎn)量大小順序?yàn)? 5 3 6 2 7 4 8 1 9綜合來(lái)看，處理5的產(chǎn)量顯著高于其他處理，因此，采用處理5 的酶液組合（1%纖維素酶 + 0.5%果膠酶）可獲得最大存活原生質(zhì)體產(chǎn)量。2022/9/818第18頁(yè)，共24頁(yè)，2022年，5月20日，20點(diǎn)22分，星期四4.酶解時(shí)間與酶液中甘露醇濃度對(duì)高山紅景天原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響：2022

9、/9/819第19頁(yè)，共24頁(yè)，2022年，5月20日，20點(diǎn)22分，星期四時(shí)間影響：14 h隨酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，原生質(zhì)體產(chǎn)量遞增，在4 h時(shí)達(dá)到最高值，以后隨時(shí)間的延長(zhǎng)，產(chǎn)量下降。酶解后期的產(chǎn)量和存活率下降，是由于酶解液長(zhǎng)時(shí)間浸泡造成部分原生質(zhì)體破裂和損傷引起的。2022/9/820第20頁(yè)，共24頁(yè)，2022年，5月20日，20點(diǎn)22分，星期四酶液中甘露醇對(duì)原生質(zhì)體產(chǎn)量和存活率的影響： 酶液中采用0.5 mol/L 甘露醇的處理經(jīng)純化后呈圓球型，可觀察到大量葉綠體的存在。因此，酶液采用0.5 mol/L 的甘露醇用于維持原生質(zhì)體滲透壓效果較好。2022/9/821第21頁(yè)，共24頁(yè)，2022年，5月20日，20點(diǎn)22分，星期四高山紅景天原生質(zhì)體培養(yǎng)與植株再生：將純化的原生質(zhì)體密度調(diào)到2105個(gè)/mL,在黑暗條件下進(jìn)行液體淺層培養(yǎng)，經(jīng)3天可見(jiàn)第一次細(xì)胞分裂，約40d時(shí)，可形成肉眼可見(jiàn)的愈傷組織。經(jīng)過(guò)23d 的弱光培養(yǎng)，將愈傷組織轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)基MS+2mg/L NAA上精心光照培養(yǎng)。繼續(xù)培養(yǎng)約45d時(shí)，愈傷組織生長(zhǎng)旺盛，并有少量芽體萌發(fā)，挑選鮮綠色愈傷組織轉(zhuǎn)入芽分化培養(yǎng)基MS+1mg/L6-BA NAA進(jìn)行芽誘導(dǎo)，待芽長(zhǎng)到2.0cm 左右，切下轉(zhuǎn)入1/2生根培養(yǎng)基上形成完整植株。20