抗體標(biāo)記技術(shù)匯總

1、第1章抗體分子標(biāo)記技術(shù)第一節(jié) 抗體的I12標(biāo)記法基本原理有多種方法可用于蛋白質(zhì)的碘標(biāo)記，如應(yīng)用化學(xué)法或酶促法通過氧化對(duì)蛋白質(zhì)分子進(jìn)行碘化是常用的方 法。當(dāng)應(yīng)用化學(xué)氧化法時(shí)，碘化鈉（NaI）遇強(qiáng)氧化劑，碘離子被氧化為碘分子，所生成的自由碘分子可與某 些基團(tuán)進(jìn)行鹵化反應(yīng)。蛋白質(zhì)分子可進(jìn)行鹵化反應(yīng)的基團(tuán)主要為酪氨酸殘基，某些組氨酸殘基也可能進(jìn)行碘 化。在應(yīng)用氯胺T（Chloramine T）法的實(shí)驗(yàn)中，所用的氧化劑（1，3，4， 6-tetrachloro-3a , 6a -diphenyl-glucoluril）是溶于強(qiáng)揮發(fā)性的有機(jī)溶劑中。該溶劑加入試管后，先讓其揮發(fā)（即讓氧化劑將試 管包被），然

2、后把阻I和蛋白質(zhì)液加入包被好的試管中，反應(yīng)完成即將混合液移入他管，以終止反應(yīng)。試劑及儀器經(jīng)親和層析純化的多克隆抗體或單克隆抗體0.5 mol/L磷酸鈉緩沖液，pH 7.5 （配法見附錄1）無載體的 Na125I 3.7GBq/ml （ 100 mCi/ml ）的 NaOH 液凝膠過濾柱Y -記數(shù)器100g/L三氯醋酸70%乙醇玻璃纖維濾氯胺T （Chloramine T）反應(yīng)用*新鮮制備的含2mg/ml氯絡(luò)胺T的0.5 mol/L磷酸鈉緩沖液（pH 7.5）；*氯胺T反應(yīng)終止緩沖液：2.4mg/ml偏重亞硫酸，10mg/ml酪氨酸，10%甘油，1g/L Xyene cyanol的PBS 液。操

3、作步驟*注意：125I對(duì)健康有害，需要保護(hù)措施。在應(yīng)用125I應(yīng)先有關(guān)同位素知識(shí)，及在有關(guān)部門的監(jiān)測(cè)下，按放射 線同位素的應(yīng)用及處置要求進(jìn)行。（一）氯胺T法用1.5ml Ependof管，加10p l抗體及pH 7.5的0.5 mol/L磷酸鈉緩沖液總體積至25p l；加 500 p Ci 的 Na125I，混勻；加25p l 2mg/ml氯胺T液，混勻；在室溫下培養(yǎng)1分鐘； 加入50p l氯胺T反應(yīng)終止緩沖液（以飽和的酪氨酸來捕獲游離的Na125I）；通過凝膠過濾層析分離將碘化抗體與碘化酪氨酸分離。將反應(yīng)混合液上1ml的凝膠過濾層析柱，分 部收集洗脫液100p l/管，碘化抗體在開始的組分排

4、出。應(yīng)用Y -記數(shù)器監(jiān)測(cè)各組分；收集、合并含碘化抗體的各管；將125I標(biāo)記的抗體管放入同位素保護(hù)管中，置4C保存。（二）lodogen-包被試管法lodogen 以 0.5p g/ml 溶于氯仿；將100p l lodogen液移入合用的玻璃試管中；試管置通風(fēng)櫥中過夜，在室溫下讓氯仿蒸發(fā)；加入50p l抗體（0.2-1mg/ml在pH 7.5的0.5 mol/L磷酸鈉緩沖液中）；加500 p Ci Na125I到加有抗體的Iodogen-包被管中，室溫保溫2分鐘；將管中反應(yīng)液轉(zhuǎn)入1.5ml Eppendof管（其中已先加有50p l Iodogen反應(yīng)終止緩沖液），輕混；通過凝膠過濾層析，將碘

5、化抗體與碘化酪氨酸分離（同前絡(luò)胺T法）；收集、混合含碘化抗體的各管；將125I標(biāo)記的抗體置同位素保護(hù)管中，放4C保存。實(shí)驗(yàn)質(zhì)量監(jiān)測(cè)應(yīng)用三氯醋酸沉淀法測(cè)定抗體標(biāo)記效率：取兩片玻璃纖維濾紙，用軟鉛筆寫標(biāo)記；將濾紙平放在試管架的孔部，使其中心部分不接觸試管架；將1-5p l含約10000cpm的樣品，準(zhǔn)確的點(diǎn)到每一張濾紙的中心，在室溫下待干；用平頭鑷子將一濾紙轉(zhuǎn)入試管，加入2ml 100g/L三氯醋酸；濾紙?jiān)谌却姿嵋褐薪D(zhuǎn)10分鐘，傾出溶液；再加入2ml 100g/L三氯醋酸，重復(fù)上述操作；加入2ml 70%乙醇，濾紙浸在乙醇中轉(zhuǎn)動(dòng)10分鐘后，傾出溶液；測(cè)定經(jīng)過洗過滌與未洗滌濾紙的放射性；由所測(cè)定

6、濾紙點(diǎn)樣中與抗體結(jié)合的125I量，計(jì)算與抗體液中與抗體結(jié)合的125I總量。洗后濾紙的cpm未洗濾紙的cpm X 100 =結(jié)合碘的比率樣品的總量/收集的分量X在洗后濾紙中的cpm =總抗體-結(jié)合放射性*與抗體結(jié)合的同位素量應(yīng)為樣品中同位素總量的70-95%。實(shí)驗(yàn)要點(diǎn)及說明用氯胺T法進(jìn)行碘化，也可在大約pH 7.0的緩沖液中進(jìn)行。均必需保證反應(yīng)體系中無還原劑存在。 如果氧化反應(yīng)損傷蛋白質(zhì)，可將氯抗體與異硫氰酸熒光素（FITC）偶聯(lián)）胺T量減少到0.02mg/ml,并 將偏重亞硫酸液的濃度降到0.024mg/ml。Iodogen-包被的試管可在干燥器中，室溫下，保存多年。125I標(biāo)記的抗體，在制備

7、后六周內(nèi)均可使用（1251的半衰期為59.6天）。要注意保證所用的Na125I是新鮮的，陳舊制劑的比活性低。酪氨酸的碘化偶爾會(huì)對(duì)抗原的抗體結(jié)合位點(diǎn)有干擾，因此降低其結(jié)合能力，但這種情況很少見。*以上同位素標(biāo)記方法中需用高度純化的抗體，以保證結(jié)果的可靠。參考文獻(xiàn)Fraker, PL .and Speck, JC (1978) Proteinand cell membrane iodination with sparkingly soluble chloramines, 1, 3, 4,6-tetrachloro-3a ,6a -diphenyl-glucoluril. Biochem. Biop

8、hys. Res. Commun. 80,849-857.Greenwood, FC., Hunter, WM. And Glover, JS. (1963) The preparation of 125-labeled human growth hormone of high specific radioactivity. J. Biochem. 89, 114-123. 孫冊(cè)，朱正美及顧天爵 放射性標(biāo)記凝集素糖復(fù)合物生化研究技術(shù)浙江大學(xué)出版社1999 pp.501-504(朱正美)抗體的酶標(biāo)記法基本原理本法是應(yīng)用偶聯(lián)劑使酶與抗體結(jié)合。即通過應(yīng)用單、雙或多功能基試劑，分別與大分子的抗體所存在

9、的 功能性基團(tuán)發(fā)生反應(yīng)，生成酶一抗體偶聯(lián)復(fù)合物。不同的醇抗體復(fù)合物制備方法中，最廣泛應(yīng)用的是第一步 加入戊二醛的方法，本法與其它偶聯(lián)方法相比，具有操作簡(jiǎn)單、反應(yīng)條件溫和，及實(shí)用面廣等長(zhǎng)處。試劑及儀器親和純化的多克隆抗體或生物化學(xué)純的單克隆抗體（5mg/ml PBS液或0.1 mol/L磷酸緩沖液pH6.8）用以標(biāo)記的酶（EIA級(jí)，有商品供應(yīng)）：辣根過氧化物酶（HRP,純度為A430/A275 3），黑曲霉葡萄糖氧化酶，小牛腸堿性磷酸酶（AKP）， 或大腸干菌8 D 一半乳糖苷酶均可選用，但以HRP最為常用。25%戊二醛液（電鏡級(jí)）0.1 mol/L磷酸鉀緩沖液（pH6.8）PBS （見附錄）2

10、 mol/L甘氨酸液蒸溜甘油透析袋（分子量6000-8000）電磁攪拌器和攪拌棒操作步驟抗體與過氧化物酶偶聯(lián)將5mg抗體與10mg酶在總體積1ml的0.1 mol/L磷酸鉀緩沖液（pH6.8）混合； 在4C對(duì)0.1 mol/L磷酸鉀緩沖液（pH6.8）透析過夜；用0.1 mol/L磷酸鉀緩沖液（pH6.8）稀釋戊二醛至1%； 向透析混合液中加入50p l稀釋過的戊二醛，在室溫下輕1輕攪拌三小時(shí)；加入2 mol/L甘氨酸液使最終濃度達(dá)到0.1 mol/L，混合液室溫放置2小時(shí)，以封閉殘存的醛基混合液在4C對(duì)PBS透析過夜；10000 X g 4。離心 30 分；將上清移入另一管中，按體積1： 1

11、加入甘油，使終濃度達(dá)50%；置-20 C保存。抗體與AKP偶聯(lián)將5mg抗體與10mg酶在總體積2ml的0.1 mol/L磷酸鉀緩沖液（pH6.8）混合；其它操作同HRP標(biāo)記法。抗體與葡萄糖氧化酶偶聯(lián)按HRP偶聯(lián)法操作，僅加入的1%戊二醛改為150 p l。抗體與0D一半乳糖昔酶偶聯(lián)按HRP偶聯(lián)法操作，但見偶聯(lián)反應(yīng)總體積改為2ml，l%戊二醛用量改為的100p l。反應(yīng)質(zhì)量測(cè)定可用抗原包被的微量板通過直接酶免疫試驗(yàn)測(cè)定偶聯(lián)度。(具體方法見-)實(shí)驗(yàn)要點(diǎn)及說明如果參與偶聯(lián)的氨基位于抗體和抗原的結(jié)合位點(diǎn)，則在偶聯(lián)反應(yīng)中，被標(biāo)記抗體的親和性能會(huì)不同 程度的受到破壞；主要影響偶聯(lián)成功率的原因是在反應(yīng)混合液

12、中有游離氨基存在，游離氨基容易和戊二醛反應(yīng)，因而 干擾蛋白質(zhì)的交連。因此，必須用絕對(duì)不含有機(jī)物的水配置緩沖液，并且反應(yīng)混合液要在偶聯(lián)前對(duì) 該緩沖液充分透析，是反應(yīng)成功的要點(diǎn)。反應(yīng)不能應(yīng)用Tris-甘氨酸緩沖液。參考文獻(xiàn)Avrameas,S. (1969) Coupling of enzymes to protein with glutaraldehyde. Use of the conjugates for the detection of antigens and antibody. Immunochemistry 5, 43-52Avrameas,S. and Ternyck, T. (1

13、971) Peroxidase labelled antibody and Fab congugates with enhanced intracellular penetration. Immunochemistry. 8(12): 1175-1179(朱正美)第三節(jié)抗體的生物素化標(biāo)記基本原理本法可使抗體或其它蛋白質(zhì)的 -氨基通過手臂與?；纳锼毓矁r(jià)結(jié)合。其后，生物素化的分子可應(yīng)用 酶標(biāo)-親和素或熒光染料-鏈霉親和素復(fù)合物來檢測(cè)。小分子的水溶性生物素對(duì)細(xì)菌蛋白鏈霉親和素具有高度 親和力是本法的設(shè)計(jì)基礎(chǔ)。試劑及儀器NHSB： N-羥基琥珀酰亞胺生物素（有商品供應(yīng)）0.1 mol/L碳酸氫鈉緩

14、沖液，pH 8.0 （見附錄）雙蒸水（注意去除游離氨基），用以配制碳酸氫鈉緩沖液或硼酸緩沖液DMSO （二甲亞颯，有毒試劑）1 mol/L NHCl4疊氮鈉（有毒試劑）PBS （見附錄）10g/L牛血清白蛋白（W/W） PBS液分子篩柱（如G25）電磁攪拌器透析袋（MW CO 8000）鋁鉑微量移液器操作步驟將待生物素化的蛋白質(zhì)用0.1 mol/L碳酸氫鈉緩沖液（pH 8.0）或0.5 mol/L硼酸緩沖液（pH 8.6）稀 釋到1mg/ml, 一般實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用的生物素化體積為1-2.5ml;交互用0.1 mol/L碳酸氫鈉緩沖液（pH 8.0）或0.5 mol/L硼酸緩沖液（pH 8.6），對(duì)

15、蛋白質(zhì)充分透析;用 1ml DMSO 溶解 NHSB 1mg；向1ml蛋白質(zhì)溶液（即含蛋白質(zhì)1mg）加入120p l NHSB溶液（即含NHSB 120 p g）；在室溫下持續(xù)攪拌，保溫2-4小時(shí)；加入9.6p L1 mol/L NH4Cl （每25 p g NHSB加1 p l），在室溫下攪拌10分鐘；在4C，對(duì)PBS充分透析，以除去游離的生物素；將樣品上1ml的分子篩柱，以PBS緩慢洗脫，收集1ml/管，蛋白質(zhì)在1-3ml之間洗下；最后，樣品加入疊氮鈉（終濃度0.5g/L）及1.0g/L BSA。將結(jié)合產(chǎn)物置4C，避光保存，亦可加入50% 重蒸甘油，置一20 C保存。質(zhì)量監(jiān)測(cè)與酶-或熒光染

16、料-結(jié)合的親和素、鏈霉親和素或中和親和素（neutravidin），通過標(biāo)準(zhǔn)方法（Western blotting或免疫熒光染色法）測(cè)定交聯(lián)率。實(shí)驗(yàn)要點(diǎn)及說明如在反應(yīng)混合液中有疊氮鈉或游離氨基存在，會(huì)抑制標(biāo)記反應(yīng)。因此，蛋白質(zhì)在反應(yīng)前要對(duì)0.1 mol/L 碳酸氫鈉緩沖液或0.5 mol/L硼酸緩沖液充分透析；所用的NHSB及待生物素化蛋白質(zhì)之間的分子比按蛋白質(zhì)表面的 -氨基的密度會(huì)有所不同，選擇不 當(dāng)則影響標(biāo)記的效率，應(yīng)先用幾個(gè)不同的分子比來篩選最適條件；用NHSB量過量也是不利的，抗原的結(jié)合位點(diǎn)可能因此被封閉，導(dǎo)致抗體失活；由于抗體的氨基不易接近可能造成生物素化不足，此時(shí)可加入去污劑如Tr

17、iton X-100,Tween 20等。當(dāng)游離 -氨基（賴氨酸殘基的氨基）存在于抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)時(shí)，或位于酶的催化位點(diǎn)時(shí)，生物 素化會(huì)降低或損傷抗體蛋白的結(jié)合力或活性。此時(shí)，應(yīng)試用其它交聯(lián)方法；生物素還可能與不同的功能基團(tuán)，如羰基、氨基、巰基、異咪唑基及苯酚基，也可與糖基共價(jià)結(jié)合 （詳見參考文獻(xiàn)1）；交聯(lián)反應(yīng)后，應(yīng)充分透析，否則，殘余的生物素會(huì)對(duì)生物素化抗體與親和素的結(jié)合產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)作用；在細(xì)胞的熒光標(biāo)記實(shí)驗(yàn)中，中和親和素的本底低，但由于鏈霉親和素含有少量正電荷，故對(duì)某些細(xì) 胞可導(dǎo)致高本底。參考文獻(xiàn)Bayer,EA. And Wilchek, M. （1980） The use of avid

18、in-biotin complex as a tool in molecular biology. Meth. Biochem. Anal. 26, 1-45.Guesdon, JL., Ternynck, T. And Avrameas, S. （1979） Thr use of avidin-biotin interaction of immuenzymatic techniques. J. Histochem. Cytochem. 27, 1131-1139.（朱正美）第四節(jié)抗體的熒光標(biāo)記法基本原理許多蛋白質(zhì)分子在其表面含有較多的賴氨酸殘基。這些賴氨酸殘基的游離：-氨基可與FITC （其

19、激發(fā)波 長(zhǎng)為492nm,發(fā)射光波長(zhǎng)為525nm）共價(jià)結(jié)合。與FITC結(jié)合的抗體可用為特異性的探針，以測(cè)定細(xì)胞相應(yīng)抗 原的存在。FITC具有很高的量子產(chǎn)量（發(fā)射光與吸收光的比值,0 .85），而且形成的偶聯(lián)物的穩(wěn)定性很好。 FITC是應(yīng)用最廣的熒光染料，流式細(xì)胞儀就按FITC的特性，設(shè)計(jì)了激光波長(zhǎng)為488 nm，很接近于FITC的最 大激發(fā)波長(zhǎng)492nm）。偶聯(lián)反應(yīng)是在pH 9.8條件下，賴氨酸殘基的游離 -氨基與FITC發(fā)生的親核反應(yīng)，由此形成硫脲連接。試劑及儀器待偶聯(lián)抗體碳酸氫鈉緩沖液：25m mol/L怛叫/ NaHC03緩沖液PH9.8 （新鮮配制，配法見附錄）PBS （見附錄）疊氮鈉（

20、有毒試劑）異硫氰酸熒光素（I型異購體，有商品供應(yīng)）電磁攪拌器鋁鉑操作步驟用碳酸氫鈉緩沖液PH9.8稀釋抗體為1-5mg/ml，或抗體對(duì)該緩沖液充分透析，以足以使賴氨酸不解離 （去其正電荷），但注意保持大部分蛋白質(zhì)仍未變性；將透析袋放入100ml含0 .1 mg/ml FITC的pH9.8碳酸氫鈉緩沖液（新配制）的燒杯中，用鋁鉑包燒 杯以避光，4C攪拌過夜；上述抗體液對(duì)PBS在4C透析以終止反應(yīng)。其間至少更換PBS液三次，直致480nm的吸收為零；加入0.5g/L的疊氮鈉。此后，結(jié)合物在4C避光保存，或分裝后在一20C凍存。熒光偶聯(lián)質(zhì)量的檢測(cè)用標(biāo)準(zhǔn)免疫熒光染色試驗(yàn)以測(cè)定偶聯(lián)率?；蛴肍/P值測(cè)定對(duì)

21、其FITC標(biāo)記質(zhì)量進(jìn)行鑒定：取結(jié)合物液0.2ml，加PBS 2.8ml （或兩者均改用半量），測(cè)定其A490/A280，查FITC標(biāo)志曲線得其濃 度p g/ml值，按IgG的消光系數(shù)（mg/ml約A280 1.2），可計(jì)算其F/P值，即每mg抗體所標(biāo)記的p gFITC的 比值，可以此鑒定及比較各批標(biāo)記物的質(zhì)量。實(shí)驗(yàn)要點(diǎn)及說明偶聯(lián)反應(yīng)要求在盡可能接近pH9.8的溶液中進(jìn)行，而且注意在反應(yīng)過程中要保持此pH水平；要確定在偶聯(lián)反應(yīng)緩沖液中不含游離氨基（Tris,氨及疊氮鈉均可與FITC反應(yīng)，因此會(huì)降低蛋白質(zhì)與FITC的偶聯(lián)率）；FITC與蛋白質(zhì)的比值(F/P),可通過測(cè)定495nm與280nm吸光度

22、來鑒定。此比值的范圍應(yīng)為0 .31.0(方法見前)；FITC唯一的缺限是易被光淬滅，因此復(fù)合物必須始終避光保存；如果FITC一復(fù)合物對(duì)PBS透析不充分，可能造成高本底，對(duì)免疫熒光染色產(chǎn)生干擾；如果被標(biāo)記的蛋白質(zhì)是第二抗體或通用的第一抗體，則從商品購置可能更方便可取。參考文獻(xiàn)The, TH and Feltkamp, TEW. (1970) Conjugation of f luorescein isothiocyanate to antobodies.Experiments on the conditions of conjugation. Immunology 18, 865-873.The

23、, TH and Feltkamp, TEW. (1970) Conjugation of fluorescein isothiocyanate to antobodies.A reproducible method. Immunology 18, 875-881(朱正美)第五節(jié)生物合成過程的標(biāo)記基本原理對(duì)生物合成過程進(jìn)行標(biāo)記，主要是為了研究蛋白質(zhì)的生化性質(zhì)、合成、加工、細(xì)胞內(nèi)傳送、分泌和降解 過程。通常將細(xì)胞放在含有充足營(yíng)養(yǎng)成分和放射性標(biāo)記氨基酸的培養(yǎng)基中，雖然蛋氨酸和半胱氨酸在蛋白質(zhì) 中的含量較低，但其35S標(biāo)記物具有特異性高（2.93 X10i3Bq/mmol）、容易檢測(cè)的特點(diǎn)，因此是進(jìn)

24、行生物合 成標(biāo)記的首選氨基酸。下列步驟是對(duì)懸浮液中細(xì)胞（脾或胸腺的單細(xì)胞懸浮液或者培養(yǎng)物）進(jìn)行短期標(biāo)記的 方法。注意事項(xiàng)：實(shí)驗(yàn)室應(yīng)具備進(jìn)行放射性化合物操作的各種相關(guān)設(shè)備。放射性工作專用的水浴槽，保溫箱和離心機(jī)；在進(jìn)行標(biāo)記操作的時(shí)候，用蓋革氏計(jì)數(shù)器監(jiān)測(cè)操作區(qū)域；做好35S固體與液體廢物的處理工作；在實(shí)驗(yàn)開始之前，要得到相關(guān)部門的批準(zhǔn)；操作中，要嚴(yán)格地遵照國(guó)家管理?xiàng)l例的要求。試劑與設(shè)備在培養(yǎng)基中的細(xì)胞冰冷卻的PBS （參見附錄A）標(biāo)記培養(yǎng)基:不含蛋氨酸、半胱氨酸的RPMI 1640培養(yǎng)基，水浴預(yù)熱到37 C35S蛋氨酸和35S半胱氨酸（800-l200 Ci/mmol = 2.93-4.44 X

25、1013 Bq/mmol）15或50 ml錐形聚丙烯離心管對(duì)標(biāo)記培養(yǎng)基充分透析的胎牛血清（FCS）L-谷氨酸.微量吸管恒溫箱離心機(jī)（冷凍）操作步驟（一）細(xì)胞的準(zhǔn)備工作在室溫下，以300 Xg離心5分鐘，收集到107-108個(gè)細(xì)胞；在錐形離心管中，用10ml 37 C的標(biāo)記培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞，然后300 X g離心5分鐘；丟棄上層清液；細(xì)胞沈淀加入標(biāo)記培養(yǎng)基，重復(fù)洗滌一次。（二）前脈沖 Prepulse洗滌后的細(xì)胞，用37 C預(yù)熱的標(biāo)記培養(yǎng)基重新懸?。? ml含20 X 106個(gè)細(xì)胞），在37 C孵育30分 鐘，間歇漩渦振蕩，以耗盡細(xì)胞內(nèi)原有的蛋氨酸和半胱氨酸；室溫解凍35S蛋氨酸和35S半胱氨酸；

26、注意：35S蛋氨酸容易揮發(fā)，請(qǐng)?jiān)趯Ｓ玫?、裝有活性炭過濾器的通風(fēng)櫥內(nèi)，打開35S蛋氨酸儲(chǔ)存液。目前，不易揮發(fā)的35S蛋氨酸和35S半胱氨酸均有商品出售。細(xì)胞液在室溫下，以300 X g離心5分鐘，棄上清。（三）脈沖Pulse將細(xì)胞團(tuán)重新懸浮于標(biāo)記培養(yǎng)基中（濃度20 X 106個(gè)細(xì)胞/1 ml）；加入 250 Mi 的 35S蛋氨酸和35S半胱氨酸（9.25 X 109 Bq）；細(xì)胞放入37。恒溫箱中，孵育30分鐘到3小時(shí)，孵育期間經(jīng)常振蕩，以保持細(xì)胞懸??；細(xì)胞液在室溫下，以300 Xg離心5分鐘，棄上清；警告：使用過的培養(yǎng)基和洗滌液均含有放射性，因此，請(qǐng)按規(guī)定方法操作和處理放射性物質(zhì)；用10ml

27、冰冷的PBS重新懸浮細(xì)胞，反復(fù)洗滌兩次；按“細(xì)胞提取液的制備”（見Protocol 43）中的方法進(jìn)行細(xì)胞處理和分析，或者-20 C凍存細(xì)胞。質(zhì)量要點(diǎn)如果脈沖需要持續(xù)1小時(shí)以上，需要在無菌的條件下，向標(biāo)記培養(yǎng)基中添加2%的胎牛血清和2%的L- 谷氨酸；對(duì)于大多數(shù)類型的細(xì)胞，可以采用帶螺口的組織培養(yǎng)瓶，并在濕潤(rùn)的、含5% CO2的培養(yǎng)箱中進(jìn)行孵育；孵育必須在37 C進(jìn)行，溫度低會(huì)顯著地減少摻入到蛋白質(zhì)中的放射性；也可以使用14C-標(biāo)記的氨基酸作標(biāo)記，其半衰期長(zhǎng)，有利于在較長(zhǎng)的時(shí)間（幾個(gè)星期）內(nèi)使用標(biāo)記的蛋 白質(zhì)，例如標(biāo)記雜交瘤B細(xì)胞分泌的單克隆抗體，就常采用14C-標(biāo)記的氨基酸混合物（絲氨酸，亮

28、氨酸， 纈氨酸）。參考文獻(xiàn)Coligan, J.E., Gates, F.T., III, Kimball, E.S. and Maloy, W.L. （ 1983） Radiochemical sequence analysis of biosynthetically labeled proteins. Meth. Enzymol. 91,413-434.Meisenhelder, J. and Hunter, T. （ 1988 ） Radioactive protein labelling techniques. Nature （London） 335, 120.（李京華朱正美）第六節(jié)免

29、疫膠體金標(biāo)記抗體及檢測(cè)抗原基本原理膠體金在光鏡和電鏡中均為有效的標(biāo)記物，可以檢測(cè)單一和多重抗原。膠體金在電解質(zhì)中不穩(wěn)定，但被 蛋白質(zhì)包被的膠體金是穩(wěn)定的。一般常用免疫球蛋白或蛋白A包被膠體金，可作標(biāo)記二抗進(jìn)行免疫檢測(cè)，本 方法應(yīng)用范圍廣，染色后的樣品可以長(zhǎng)期保存。試劑和設(shè)備超速離心機(jī)顯微鏡溫箱分光光度計(jì)0.2 um微孔濾膜載玻片，蓋薄片，濾紙氯金酸鈉1%檸檬酸鈉水溶液山羊抗鼠Ig抗體對(duì)T淋巴細(xì)胞特異的鼠抗人單克隆抗體自人外周血分離的白細(xì)胞懸液10%氯化鈉1%聚乙二醇0.01mol/L pH7.2 的 PBS1%戊二醛乙醇溶液50%硝酸銀溶液（提前一天配制）明膠顯影液，2g明膠溶解于99ml蒸餾水中，加1 ml甲酸操作步驟（一）膠體金溶液制備稱取0.1g氯金酸鈉，溶解于1L去離子水中；加熱煮沸，劇烈攪拌下，迅速加入25ml新配的1%檸檬酸鈉溶液；繼續(xù)煮沸5分鐘，至溶液變成桔紅色；用蒸餾水將溶液