環(huán)境微生物實驗

1、專業(yè)：_姓名：_學號：_日期：_地點：_專業(yè)：_姓名：_學號：_日期：_地點：_課程名稱：_指導老師：_成績：_實驗名稱：_實驗類型：_同組學生姓名：_一、實驗目的和要求（必填）二、實驗內容和原理（必填）三、主要儀器設備（必填）四、操作方法和實驗步驟五、實驗數(shù)據(jù)記錄和處理六、實驗結果與分析（必填）七、討論、心得裝 訂 線一、實驗目的和要求裝 訂 線1、了解普通光學顯微鏡的基本構造和工作原理。2、學習并掌握普通光學顯微鏡，重點是油鏡的實用技術和維護知識。3、在油鏡下觀察細菌的幾種基本形式。4、采用懸滴法在高倍鏡下觀察細菌運動。基本內容和基本原理（一）普通光學顯微鏡的構造普通光學顯微鏡由機械系統(tǒng)和

2、光學系統(tǒng)兩部分組成。機械系統(tǒng) 機械系統(tǒng)包括鏡座、鏡臂、鏡筒、物鏡轉換器、載物臺、調節(jié)器等。（1）鏡座：它是顯微鏡的基座，可視顯微鏡平穩(wěn)地放置在平臺上。（2）鏡臂：用以支持臂筒，也是移動顯微鏡時手握的部位。（3）臂筒：它是連接目鏡和接物鏡的金屬圓筒。鏡筒上端插入目鏡，下端與物鏡轉換器相接。鏡筒長度一般固定，通常是160mm。有些顯微鏡的鏡筒長度可以調節(jié)。（4）物鏡轉換器：它是一個用于安裝物鏡的圓盤，位于鏡筒下端，其上裝有35個不同放大倍數(shù)的物鏡。為了使用方便，物鏡一般按由低倍到高倍的順序安裝。轉動物鏡轉換器可以選用合適的物鏡，轉換物鏡時，必須用手旋轉圓盤，切勿用手推動物鏡，以免松脫物鏡而導致?lián)p壞

3、。（5）載物臺：載物臺又稱鏡臺，是放置標本的地方，呈方形或圓形。載物臺上裝有壓片夾，可以固定被檢標本；裝有標本移動器，轉動螺旋可以使標本前后或左右移動。有些標本移動器上刻有標尺，可指示標本的位置，便于重復觀察。（6）調節(jié)器：調節(jié)器又稱調焦裝置，由粗調螺旋和細螺旋組成，用于調節(jié)物鏡與標本間的距離，使物鏡更清晰。粗調螺旋轉動一圈可使鏡筒升降約10mm，細調螺旋轉動一圈可使鏡筒升降約0.1mm。2、光學系統(tǒng)光學系統(tǒng)包括目鏡、物鏡、聚光器、反光鏡等。目鏡：它的功能是把物鏡放大的物象再次放大。目鏡一般由兩塊透鏡組成。上面一塊稱接目透鏡，下面一塊稱為場鏡。在兩塊透鏡之間或在場鏡下方有一光闌。由于光闌的大小

4、決定著視野的大小，故又稱它為視野光闌。標本成像于光闌限定的范圍之內，在光闌上粘一小段細發(fā)可用作指南針，指示視野中標本的位置。再進行顯微測量時，目鏡測微尺被安裝在視野光闌上。目鏡上可有5、10、15、20等放大倍數(shù)?？砂葱枋褂?。物鏡：它的功能是把標本放大，產生物像。物鏡可分為低倍數(shù)（4或10）、中倍鏡（20）、高倍鏡（4060）和油鏡（100）。一般有油鏡上刻有“OI”或“HI”字樣，有的刻有一圈紅線或黑線，以示區(qū)別。物鏡上通常標有放大倍數(shù)、數(shù)值孔徑、工作距離、及蓋玻片厚度等參數(shù)。以油鏡為例，100/1.25表示放大倍數(shù)為100倍，NA為1.25；160/0.17表示鏡筒長度160mm，蓋玻片厚

5、度等于或小于0.17mm。（3）聚光器：聚光器又稱聚光鏡，它的功能就是把平行的光線聚焦于標本上，增強照明度。聚光器安裝在鏡臺下，可上下移動。使用低倍物鏡時應降低聚光器，使用油鏡時則應升高聚光器。聚光器上附有虹彩光闌，通過調整光闌孔徑的大小，可以調節(jié)進入物鏡光線的強弱。在觀察透明標本時，光圈宜調得相對小一些，這樣雖會降低分辨力，但增強反差，便于看清標本。 （4）反光鏡：它是普通光學顯微鏡的取光設備，其功能是采集光線，并將光線射向聚光器。反光鏡安裝在聚光器下方的鏡座下，可以在水平與垂直兩個方向上任意旋轉。反光鏡的一面是凹面鏡，另一面是平面鏡。一般情況下選用平面鏡、光量不足時可換用凹面鏡。 （二）普

6、通光學顯微鏡的性能 1、數(shù)值孔徑 數(shù)值孔徑（NA）又稱開口率，是指介質折射率與鏡口角1/2正弦的乘積?？捎檬?-1表示。 其中n為物鏡與標本之間介質的折射率，為鏡口角。物鏡的性能與物鏡的數(shù)值孔徑密切相關，數(shù)值孔徑越大，物鏡的性能越好。因為鏡口角總是小于180，所以sin(/2)的最大值不可能超過1.又因為空氣的折射率為1，所以以空氣的介質的數(shù)值孔徑不可能大于1，一般為0.05-0.95。根據(jù)式1-1，要提高數(shù)值孔徑，一個有效途徑就是提高物鏡與標本之間介質的折射率。使用香柏油浸沒物鏡理論上可將數(shù)值孔徑提高至1.5左右；實際數(shù)值孔徑也可達到1.2-1.4。 2、分辨率 分辨率是指分辨物象細微結構的

7、能力。分辨率常用可分辨出的物象兩點間的最小距離（D）來表征（式1-2）。D值愈小，分辨率愈高。式1-2中，位光波波長。比較式1-1和式1-2可知，D可表示為：根據(jù)式（1-3），在物鏡數(shù)值孔徑不變的條件下，D值的大小與光波波長成正比。要提高物鏡的分辨率，可通過兩條途徑：采用短波光源。加大物鏡數(shù)值孔徑。放大率普通光學顯微鏡利用物鏡和目鏡來放大圖像，采用普通光學顯微鏡觀察標本時，標本先被物鏡第一次放大，再被目鏡第二次放大。所謂放大率就是物鏡放大倍數(shù)與目鏡放大倍數(shù)的乘積。焦深一般講焦點所處的像面稱為焦平面。在顯微鏡下觀察標本時，焦平面上的物像比較清晰，但除了能看見焦平面上的物像外，還能看見焦平面上面和

8、下面的物像，這兩個面之間的距離稱為焦深。數(shù)值孔徑和放大率越大，焦深越小。主要儀器設備1、菌種：培養(yǎng)12-18小時的枯草桿菌斜面拍楊武3-4支。2、標片本：細菌三種基本形態(tài)的染色標本、特殊形態(tài)細菌染色標本。3、儀器及相關用品：顯微鏡、油、乙醚酒精溶液、擦鏡紙。4、其他用品：蓋玻片、凹玻片、吸水紙、酒精燈、接種環(huán)、牙簽、凡士林等操作方法和實驗步驟 （一）顯微鏡（油鏡）操作。領取并檢查顯微鏡。調節(jié)光源：降低背景旋轉到工作位置，用粗調螺旋提升鏡筒，使鏡頭距離載物臺10mm左右，降低聚光鏡位置，完全打開彩虹光闌，一邊看目鏡，一邊調節(jié)反光鏡鏡面角度。然后調節(jié)聚光鏡位置，直至視野內得到均勻適宜的光亮。低倍鏡

9、觀察：使用低倍鏡觀察，視野較廣，焦深較大，便于搜尋目標，因此宜從低倍鏡開始觀察。將載玻片標本置于載物臺中央，用壓片夾定，并將標本部位移動到正中，轉動調節(jié)粗螺旋，使鏡頭與標本距離降到10mm左右。然后一邊看目鏡視野，以便調節(jié)粗螺旋緩慢升高鏡頭，至視野內出現(xiàn)出現(xiàn)物像，改用細螺旋，繼續(xù)調節(jié)焦距和照明，并獲清晰的物像，并將所需部位移動到視野中央，再換中、高倍鏡觀察。 4、中、高倍鏡觀察：依次用中、高倍鏡觀察低倍鏡下鎖定的部位，并隨著放大倍數(shù)的增加，逐步提升聚光器增強光線亮度。找出所需目標，并將其移至視野中央。5、油鏡觀察：將聚光器提升至最高點，轉動轉換器，移開高倍鏡，使高倍鏡和油鏡形成“八”字形，在標

10、本中央滴一小滴香柏油，把油鏡鏡頭浸入香柏油中，微微轉動細調焦螺旋，直至看清物像。如果上升至離開油面還未看清還未看清，則需重新調整?？蓮膫让孀⒁?，小心地轉動粗調節(jié)器將鏡頭重新浸在油中，但不能讓鏡頭壓在標本上，以免擊碎玻片，損壞鏡頭。6、用后復原：觀察完畢，轉動粗調螺旋提升鏡筒，取下載玻片，先用擦拭紙擦去鏡頭上的香柏油，然后用擦面紙蘸取少許少許二甲苯或1:1乙醚酒精溶液，擦去鏡頭上的殘留油痕，再用干凈的擦鏡紙擦去洗鏡液。降低臂筒，將物鏡轉成“八”字形置于載物臺上。降低聚光器，避免聚光器與物鏡相碰。使反光鏡垂直于鏡座，以防受損。（二）細菌形態(tài)觀察1、結合顯微鏡的使用，觀察細菌的三種基本形態(tài)，包括球菌

11、、桿菌以及螺旋菌。2、看示范鏡，觀察葡萄球菌、四聯(lián)球菌、鏈球菌、炭疽芽孢桿菌的芽孢、鉀細菌的夾膜、枯草桿菌的鞭毛。（三）細菌運動性觀察有些細菌具有鞭毛，能在水中自由運動。本實驗中運用懸滴法觀察。懸滴法：取一潔凈的蓋玻片，用牙簽挑取少量凡士林，涂抹于蓋玻片四角；再按無菌操作要求，用接種環(huán)從斜面底部去培養(yǎng)1218小時的枯草桿菌菌液一環(huán)，置蓋玻片中央；接著取凹玻片一塊，將凹窩向下覆蓋在帶有菌液的蓋玻片上；翻轉凹玻片，使液滴懸于蓋玻片表面。懸滴片制成后，先用低倍鏡找到水滴，再換高倍鏡觀察，可以看到活躍的細菌運動。實驗數(shù)據(jù)記錄和處理P.實驗名稱：_姓名：_學號：_P.裝 訂 線裝 訂 線實驗結果與分析

12、（一）實驗結果1、通過顯微鏡觀察，可以發(fā)現(xiàn)細菌存在球菌、桿菌、螺旋菌三種形態(tài)。2、在示教片觀察中，葡萄球菌和四鏈球菌的細菌聚集形狀不同，葡萄球菌聚集的形狀像一個葡萄并且聚集細菌數(shù)量較多，而四聯(lián)球菌則只有四個球菌聚集在一起。3、我們可以通過觀察炭疽芽孢桿菌了解到芽孢的形狀，透過鉀細菌觀測莢膜，透過枯草桿菌觀測鞭毛。同時上述三種細菌不同于葡萄球菌、四鏈球菌的細菌聚集方式，是單個細菌分散分布。4、懸滴法觀測帶鞭毛的細菌運動時可以觀測到帶鞭毛的細菌運動是沒有規(guī)則的，且運動速度較快。（二）實驗分析1、當需要移動光學顯微鏡時，不能夠單手拎鏡臂，需要用右手緊握鏡臂，左手托住鏡座。2、觀察標本時，應該嚴格按照

13、低倍、中倍、高倍、油鏡的順序依次使用，同時在調焦時，要依次轉動粗調焦螺旋和細準焦螺旋。在使用高倍鏡、油鏡時，不能夠轉動粗調焦螺旋降低鏡筒，以免造成玻片的碎裂或者鏡頭的損壞。3、在觀察細菌運動性觀察的實驗中，可不使用油鏡進行觀測。而在其他需要使用油鏡觀察的操作中一定要在低倍、中倍、高倍觀察時確保視野中的物像是相對較為清晰的，否則會造成在油鏡觀察時尋找不到清晰的物像，導致需要重新進行實驗。（三）、實驗心得第一次在大學接觸到顯微鏡的使用以及對細菌的觀察，我認為總的來說我能夠依靠老師的講解以及正確的操作順序順利得到清晰的物像。整個實驗過程需要較強的耐心和細心，找到一個清晰的物像需要較長時間的調整，同時

14、要嚴格按照低倍、中倍、高倍、油鏡的順序，一不小心就有可能需要重新進行操作。思考題1、使用顯微鏡的油鏡時，為什么必須使用鏡頭油？當使用普通高倍或低倍物鏡時,透鏡的孔徑較大,所以射入物鏡的光線因為折射而損失的比率不高,對觀察影響不大.但油鏡由于需要放大更高的倍數(shù),其鏡孔徑很小,射入的光線很少,視野不明亮,物象模糊不清。加油的目的就是讓油鏡與載物玻片之間加一層與玻璃折光率相近的香柏油介質,使通過的光線不產生或少產生折射,增加進入透鏡的光線,使視野亮度增加,能更清楚的觀察物象。比較低倍鏡及高倍鏡和油鏡在數(shù)值孔徑、分辨率、放大率和焦深方面的差別。鏡頭數(shù)值孔徑分辨率放大率焦深低倍鏡0.25110010大高

15、倍鏡0.6542340中油鏡1.25220100小由上述表格可以看出，低倍鏡和高倍鏡的NA都小于1，而油鏡NA大于1；從低倍鏡、高倍鏡到油鏡，分辨率不斷增大，焦深不斷減小。鏡檢標本時，為什么先用低倍鏡觀察，而不直接用高倍鏡或油鏡觀察？使用低倍鏡可以較快較為準確地尋找到物像，且不易造成玻片的損壞，在低倍鏡找到物像后再依次使用高倍鏡、油鏡時，只要稍加調焦便能夠得到清晰的物像。而如果直接使用高倍鏡或者油鏡，則很難尋找到物像，同時有可能還會由于物鏡和玻片位置過于接近而導致玻片或者物鏡的損壞。簡述芽孢、鞭毛、莢膜的染色原理。 芽孢染色：用著色力強的染色劑孔雀綠在加熱條件下染色，使染料不僅進入菌體也可以進入芽孢內，進入菌體的染料經(jīng)水洗后被脫色，而進入芽孢一經(jīng)著色則很難被水洗脫色。當用復染劑染色后，芽孢仍保留初染劑的顏色，而菌體和芽孢囊被染成復染劑的顏色，使芽孢