斑馬魚動物模型的應(yīng)用介紹

1、斑馬魚動物模型的應(yīng)用斑馬魚(Danio rerio)屬于輻鰭亞綱(Actinopterygii)鯉科(Cyprinidae )短擔(dān)尼魚屬(Danio) 的一種硬骨魚，原產(chǎn)于南亞，是一種常見的熱帶觀賞魚，因其體側(cè)具有斑馬一樣暗藍(lán)與銀色 相間的紋條而得名。斑馬魚個體小，易于飼養(yǎng)，成體長4-5cm，雄魚體修長，雌魚體肥大?？稍谟邢蘅臻g里 養(yǎng)殖相當(dāng)大的群體，可滿足樣本需求量大的研究。斑馬魚發(fā)育迅速，在28.5C培養(yǎng)條件下受 精后約40min完成第一次有絲分裂，之后大約每隔15min分裂一次，24h后主要器官原基形 成，相當(dāng)于28d的人類胚胎，幼魚孵出后約3個月達(dá)到性成熟。雌雄魚通過調(diào)控光周期控制 14

2、:10 (光照:黑暗)產(chǎn)卵時間，成熟魚每周可產(chǎn)卵一次，一尾雌魚每次可產(chǎn)卵100-300枚。 胚胎體外受精，體外發(fā)育，胚體透明，易于觀察。受精卵直徑約1mm，易于進(jìn)行顯微注射 和細(xì)胞移植等操作。一、斑馬魚的品系經(jīng)過30多年的研究應(yīng)用和系統(tǒng)發(fā)展，已有約20個斑馬魚品系，斑馬魚基因數(shù)據(jù)庫-ZFIN ( HYPERLINK http:/zfin/org)%e9%87%8c%e6%9c%89%e7%9b%b8%e5%85%b3%e7%9a%84%e8%b5%84%e6%96%99%e5%8f%af%e4%be%9b%e6%9f%a5%e8%af%a2%e5%92%8c%e4%b8%8b%e8%bd%bd

3、%e3%80%82%e7%9b%ae%e5%89%8d%e7%a0%94%e7%a9%b6%e4%b8%ad%e5%b8%b8%e7%94%a8%e7%9a%84%e6%96%91%e9%a9%ac%e9%b1%bc%e9%87%8e%e7%94%9f%e5%9e%8b%e5%93%81%e7%b3%bb%e4%b8%bb http:/zfin/org)里有相關(guān)的資料可供查詢和下載。目前研究中常用的斑馬魚野生型品系主 要為AB品系、Tuebingen (Tu)品系、WIK品系，斑馬魚基因組計劃所用品系是Tu。AB 品系是實驗室常用的斑馬魚品系，由單倍體細(xì)胞經(jīng)早期加壓法獲得。Tu品系斑馬魚具有胚

4、 胎致死突變基因，用于基因組測序前敲除該致死突變基因。WIK品系較Tu品系具有更多的 形態(tài)多樣性。此外，還保存有3000多個突變品系和100多個轉(zhuǎn)基因品系。這些品系資源對 于利用斑馬魚開展各種科學(xué)研究起著很大的推動作用。二、斑馬魚突變品系的篩選斑馬魚突變的方法主要有三種：已基亞硝脲(ENU)化學(xué)誘導(dǎo)、Y或x射線照射和插 入誘變。ENU是一種DNA烴基化試劑，在生殖細(xì)胞減數(shù)分裂前誘導(dǎo)堿基對的替換，誘導(dǎo)產(chǎn) 生的突變率為0.1%-0.2%，涉及單個基因的突變。射線照射導(dǎo)致染色體大片段的缺失或染色 體重排，產(chǎn)生突變率達(dá)1%。插入誘變是以逆轉(zhuǎn)錄病毒為載體，用顯微注射法將目的基因片 段導(dǎo)入斑馬魚受精卵，整

5、合到基因組中，干擾正?；虮磉_(dá)。射線照射產(chǎn)生的突變率是ENU 化學(xué)誘導(dǎo)的10倍，但由于突變涉及多個基因，突變的表型是受若干基因調(diào)控的結(jié)果，不利 于基因功能的分析，因此，ENU化學(xué)誘導(dǎo)法是斑馬魚突變的主要方法。研究含有純合致死 基因或隱形突變基因的突變表型時，可通過早期加壓法（EP）處理母本獲得的單倍體卵細(xì) 胞獲得二倍體純合子。三、斑馬魚作為人類疾病動物模型的生物學(xué)特性斑馬魚在基因水平上87%與人類同源，早期發(fā)育與人類極為相似，已成為研究相關(guān)疾 病基因的最佳模式生物。篩選斑馬魚胚胎或成魚基因庫中類似于人類致病或特定功能的基 因，構(gòu)建進(jìn)斑馬魚受精卵中，觀察特定基因在斑馬魚胚胎發(fā)育過程所起作用。斑馬

6、魚胚胎發(fā) 育是全透明的，可以全程觀察并研究其發(fā)育狀況。目前，斑馬魚模式生物的使用正逐漸拓展 和深入生命體的多種系統(tǒng)（例如，神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)等）的發(fā)育、功能和疾 ?。ɡ纾窠?jīng)退行性疾病、心血管疾病、免疫系統(tǒng)疾病等）的研究中，并已用于小分子化 合物的規(guī)模新藥篩選。3.1神經(jīng)系統(tǒng)模型斑馬魚研究表明，神經(jīng)特異性鈉離子通道大量表現(xiàn)在中樞和周邊感覺神經(jīng)系統(tǒng)，有效調(diào) 控神經(jīng)的興奮性，其基因表達(dá)調(diào)控及信號通路是神經(jīng)學(xué)研究重點(diǎn)。阿爾茨海默氏病（AD）是一種由于大腦神經(jīng)細(xì)胞死亡而造成的神經(jīng)退行性疾病。AD 與淀粉樣蛋白（AB）的過量表達(dá)沉積有關(guān)，AB是由APP連續(xù)切割產(chǎn)生，而早老素增強(qiáng)子 （pen

7、-2）和前咽陷子（Aph-1）參與A B的產(chǎn)生。研究表明，將斑馬魚相關(guān)基因的表達(dá)進(jìn)行 敲除，發(fā)現(xiàn)Pen-2與P53依賴型神經(jīng)細(xì)胞的存活有重要作用。并且在構(gòu)建綠色熒光蛋白（GFP） 轉(zhuǎn)基因斑馬魚品系中，發(fā)現(xiàn)在2-3月齡轉(zhuǎn)基因斑馬魚大腦中，廣泛大量表達(dá)GFP-APP。這 些說明斑馬魚神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育在進(jìn)化上和人類的保守關(guān)系。帕金森氏?。≒D）與多巴胺能（DA）通路的破壞有關(guān)。神經(jīng)毒物MPTP對人類中腦多 巴胺能神經(jīng)細(xì)胞的損傷現(xiàn)象與PD類似。研究者將多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白抑制物和MPTP共同作用 于斑馬魚幼魚，發(fā)現(xiàn)這些藥物具有保護(hù)多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞的作用。3.2心血管系統(tǒng)模型斑馬魚胚胎期和幼魚期為透明體，這為心血

8、管發(fā)育的研究提供了良好模型。研究發(fā)現(xiàn)， 斑馬魚的心臟受損后具有自動修復(fù)功能，這是首次發(fā)現(xiàn)脊椎動物的心臟具有再生功能，為探 尋人類心臟受損修復(fù)帶來希望。斑馬魚突變品系可作為研究心臟節(jié)律、心臟管形成、瓣膜發(fā) 生和心臟環(huán)化的模型。例如，突變品系gridlock （gdl）可用于研究人類主動脈縮窄疾病。克 隆與斑馬魚同源的人類載脂蛋白基因apoE和apoA-1，發(fā)現(xiàn)這些蛋白對哺乳動物脂質(zhì)的吸收 和分布具有重要作用，而Apo-1在AD治療中也有重要作用。胚胎注射血管內(nèi)皮因子（VEGF） 的斑馬魚在發(fā)育過程中可以觀察到明顯的新生血管，而腫瘤的發(fā)生與轉(zhuǎn)移又與血管新生有密 切關(guān)系，這啟發(fā)人們通過阻斷VEGF抑

9、制血管增生而治療腫瘤。3.3免疫疾病模型和感染疾病模型斑馬魚具有較完整的特異性免疫系統(tǒng)，體內(nèi)的T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞具有免疫活性， 非特異性免疫系統(tǒng)也呈現(xiàn)出與人類的相似性，同時保留了 TLR信號通道。成魚體內(nèi)注射細(xì) 菌和胚胎浸沒感染法可使斑馬魚感染細(xì)菌，有效建立相應(yīng)的細(xì)菌發(fā)病機(jī)理研究模型。海分枝 桿菌感染的斑馬魚體內(nèi)的肺結(jié)核肉芽腫和人類一樣出現(xiàn)干酪樣壞死，該模型可能在肺結(jié)核研 究中發(fā)揮重要作用。3.4腫瘤模型腫瘤是造成人類死亡的主要原因之一，斑馬魚可以自發(fā)產(chǎn)生腫瘤，并且許多腫瘤與人類 腫瘤非常相似，因此，斑馬魚作為最有前途且最廉價的模式生物而被廣泛的應(yīng)用。腫瘤模型 的構(gòu)建主要是通過移植術(shù)、化學(xué)

10、誘變和基因突變獲得。移植術(shù)即直接將腫瘤細(xì)胞注射到不同 發(fā)育階段的斑馬魚的特定部位，或者將含有GFP表達(dá)基因的腫瘤細(xì)胞顯微注射到斑馬魚胚 胎或幼魚中。化學(xué)誘變可以快速獲得斑馬魚腫瘤模型，例如，誘變劑處理斑馬魚胚胎或幼魚 可以獲得肝癌、血管瘤、細(xì)胞間質(zhì)瘤等。但是化學(xué)誘變會引起非特異性表型，而且腫瘤定位 困難?；蛲蛔儎t是將含有GFP報告基因的腫瘤基因通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)導(dǎo)到斑馬魚體中，可用以 進(jìn)一步鑒定腫瘤發(fā)生的分子機(jī)制。3.5視網(wǎng)膜自動修復(fù)機(jī)能斑馬魚研究發(fā)現(xiàn)，斑馬魚視網(wǎng)膜具有可再生放射狀膠質(zhì)細(xì)胞，這些細(xì)胞可分化為健康的 視網(wǎng)膜細(xì)胞，并能自動修復(fù)受損視網(wǎng)膜。人類視網(wǎng)膜擁有類似斑馬魚的放射狀膠質(zhì)細(xì)胞，但 是這

11、些細(xì)胞無活性。研究人員已成功將放射狀角質(zhì)細(xì)胞分化的視網(wǎng)膜細(xì)胞移植到老鼠上，這 為激活人類放射狀膠質(zhì)細(xì)胞的研究奠定了重要的基礎(chǔ)。四、斑馬魚在發(fā)育遺傳學(xué)中的應(yīng)用斑馬魚作為發(fā)育生物學(xué)模式生物有很多優(yōu)勢，胚胎清透可見，從受精卵發(fā)育到完整的胚 胎形成只需24h，發(fā)育過程便于觀察。GFP轉(zhuǎn)基因技術(shù)的運(yùn)用可對特定組織進(jìn)行實時觀察。 可對批量樣本進(jìn)行免疫組化或熒光免疫研究。可對胚胎進(jìn)行顯微注射DNA或RNA，影響基 因表達(dá)。嗎啉代(morpholino)基因敲除技術(shù)和異位基因表達(dá)技術(shù)是目前斑馬魚發(fā)育遺傳學(xué)研究 中的新興技術(shù)。2000年，有研究者提出注射嗎啉代修飾性寡聚核苷酸可產(chǎn)生基因敲除斑馬 魚。嗎啉代有抑制

12、翻譯起始，減少傳統(tǒng)反義寡聚核苷酸非特異性的效應(yīng)。注射嗎啉代能產(chǎn)生 以往證實的基因突變的擬表型，有助于確定功能基因。嗎啉代寡核苷酸正成為快速、高效的 基因敲除方法。對越早期胚胎注射外源基因，基因表達(dá)范圍就越廣，異位基因表達(dá)技術(shù)就是 為使基因在斑馬魚特定細(xì)胞、組織和特定時間表達(dá)而建立的一系列新技術(shù)。如RNA caging 技術(shù)，RNA與RNA caging共價結(jié)合時處于非活性狀態(tài)，經(jīng)特定波長照射，RNA caging被 破壞，激活RNA，基因得以表達(dá)。同樣，激光誘導(dǎo)基因表達(dá)技術(shù)即外源基因與熱休克蛋白 啟動子重組，激光熱敏效應(yīng)啟動基因表達(dá)。五、斑馬魚在生態(tài)毒理學(xué)中的應(yīng)用斑馬魚模型最早用于發(fā)育生物學(xué)和

13、遺傳學(xué)研究，近幾年，斑馬魚模型逐漸應(yīng)用于生態(tài) 毒理研究和檢測技術(shù)。5.1常規(guī)毒性實驗中的應(yīng)用斑馬魚模型可用于急性毒性實驗、慢性毒性實驗，以及蓄積毒性實驗。斑馬魚急性毒性 實驗用于檢測各種農(nóng)藥、有機(jī)試劑和污染物等的急性毒性。斑馬魚胚胎比成年斑馬魚敏感， 對于急性毒性方面是一個很好研究模型，可于顯微鏡下觀察胚胎發(fā)育的生態(tài)毒理學(xué)終點(diǎn)。慢 性毒性實驗測定低濃度污染物在斑馬魚生活周期內(nèi)的毒性作用，來確定化學(xué)物質(zhì)最大容許濃 度及其影響程度。通過慢性毒性實驗可觀察同種魚在不同發(fā)育階段（發(fā)育代）對化學(xué)物質(zhì)的 毒性差異。蓄積實驗則檢測外來化學(xué)物質(zhì)在機(jī)體內(nèi)蓄積或富集性大小的實驗。5.2分子及細(xì)胞生態(tài)毒理中的應(yīng)用化學(xué)物質(zhì)進(jìn)入生物體后，對生物產(chǎn)生不同程度的危害。生物在受到損傷或致死前，其 行為、生理、生化已發(fā)生反應(yīng)，可以選擇這些在分子和細(xì)胞水平上的指標(biāo)測定化學(xué)物質(zhì)對生 物的影響。例如，在斑馬魚胚胎發(fā)育晚期，硫代硫酸鈉可刺激胚胎細(xì)胞的大量異常增殖，這 些異常細(xì)胞會引起胚胎的部分器官發(fā)育畸形?？赏ㄟ^胚胎、軟骨組織染色，或全組織包埋原 位雜交等技術(shù)進(jìn)行顯微觀察。5.3水質(zhì)檢測中的應(yīng)用運(yùn)用轉(zhuǎn)基因斑馬魚的某些效用元件來顯示其接觸的特定污染物可檢測水質(zhì)的變化。例 如，斑馬魚可檢測水環(huán)境中雌激素污染，當(dāng)水樣中存在一定濃度的雌激素時，會發(fā)現(xiàn)斑馬魚 發(fā)育過程中出現(xiàn)