11結(jié)構(gòu)生物學(xué)實驗技術(shù)原理

1、第十一節(jié)結(jié)構(gòu)生物學(xué)技術(shù)概論授課教師：李旭授間第十一節(jié)結(jié)構(gòu)生物學(xué)技術(shù)概論授課教師：李旭授間結(jié)構(gòu)生物學(xué)：以生物大分子的特定空間結(jié)構(gòu)及結(jié)構(gòu)的特定運動與結(jié)構(gòu)生物學(xué)：以生物大分子的特定空間結(jié)構(gòu)及結(jié)構(gòu)的特定運動與其生物學(xué)功能的關(guān)系為基礎(chǔ)，闡明生命現(xiàn)象的學(xué)科X射線晶體學(xué)是一門利用X射線來X射線晶體學(xué)是一門利用X射線來研究晶中原子排列的學(xué)更準(zhǔn)確地說，利用電子對X射線的散射射線晶體學(xué)可以獲得晶體中電子密度的分布情X射線的波長范圍(0.01100)與成鍵原子之間的距X射線的波長范圍(0.01100)與成鍵原子之間的距離(12附近)可比，因此X射線可用于研究各類分因為沒有X射線透鏡可以聚焦X射線，到目前為止晶體可被

2、視為三光根據(jù)勞艾斑晶體可被視為三光根據(jù)勞艾斑點的分布可算出晶面間距，進而完成生物大分子所能測定的生物大分子的分子量范圍很寬（可以從1kDa以所能測定的生物大分子的分子量范圍很寬（可以從1kDa以下到400kDa甚至更大技術(shù)成熟度比較應(yīng)用成本比較低缺點是必須預(yù)先出適合于X射線衍射氣相擴散氣相擴散室溫毛細管衍射室溫毛細管衍射數(shù)據(jù)收 使用比較方便，成本較低。但是，由于封裝晶殘留的結(jié)晶母液密封的薄壁玻璃毛細管液氮低溫冷 使用相對不便，成本偏高。但是，由于無玻璃毛細管使得吸收效應(yīng)大大減少，而且晶體的低液氮低溫冷 使用相對不便，成本偏高。但是，由于無玻璃毛細管使得吸收效應(yīng)大大減少，而且晶體的低液氮氣流維持

3、冷凍狀態(tài)分子置換分子置換同晶置換反常散射核 原子核在外磁場中吸收特定頻率電磁波的現(xiàn)象核磁是磁矩不為零的原子核，在外磁場作用下自旋能級發(fā)生塞曼，吸收某一定核 原子核在外磁場中吸收特定頻率電磁波的現(xiàn)象核磁是磁矩不為零的原子核，在外磁場作用下自旋能級發(fā)生塞曼，吸收某一定半數(shù)以上的原子核具有自旋，旋轉(zhuǎn)時產(chǎn)生一小磁場。當(dāng)加一外磁場，這些原子核的能級將， 在外磁場B0半數(shù)以上的原子核具有自旋，旋轉(zhuǎn)時產(chǎn)生一小磁場。當(dāng)加一外磁場，這些原子核的能級將， 在外磁場B0條件：=a條件：=ab、溫度等等)的狀態(tài)下，對蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)進行、溫度等等)的狀態(tài)下，對蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)進行液相核磁技術(shù)通過原子核弛豫過程可以在原的原

4、子核，如1H，13C，15N和對于分子量較小的短肽和分子量小于10k的蛋白質(zhì)，以使用未標(biāo)記的樣品通過二維氫譜進行化學(xué)位移而對于分子量大于10k而小于25k的蛋白質(zhì)，由于氫譜的譜峰比較嚴(yán)重，需要使用13C和15N標(biāo)記的樣品，一系列的1H，13C，15N的原子核，如1H，13C，15N和對于分子量較小的短肽和分子量小于10k的蛋白質(zhì)，以使用未標(biāo)記的樣品通過二維氫譜進行化學(xué)位移而對于分子量大于10k而小于25k的蛋白質(zhì)，由于氫譜的譜峰比較嚴(yán)重，需要使用13C和15N標(biāo)記的樣品，一系列的1H，13C，15N譜圖進行化學(xué)位移歸同種核由于在分子中的化學(xué)環(huán)境不同而在不同共振磁感應(yīng)強度下顯示吸收峰，這稱為化學(xué)

5、位移（chemical根據(jù)前面的基本原理，在某一照射頻率下，只能但實驗證明：當(dāng)1H在分子中所處化學(xué)環(huán)境（化學(xué)環(huán)境同種核由于在分子中的化學(xué)環(huán)境不同而在不同共振磁感應(yīng)強度下顯示吸收峰，這稱為化學(xué)位移（chemical根據(jù)前面的基本原理，在某一照射頻率下，只能但實驗證明：當(dāng)1H在分子中所處化學(xué)環(huán)境（化學(xué)環(huán)境子的運動情況）不同時，即使在相同照射頻率下，也OCH3C C NHOHHOCCCOCCOCH3C C NHOHHOCCCOCC由于局部化學(xué)環(huán)境的差別，蛋白質(zhì)分子中每一個核磁譜圖的第一步就是要獲得蛋白質(zhì)信號的各個原子的化學(xué)位子中能產(chǎn)生核值，這稱為由于局部化學(xué)環(huán)境的差別，蛋白質(zhì)分子中每一個核磁譜圖的第

6、一步就是要獲得蛋白質(zhì)信號的各個原子的化學(xué)位子中能產(chǎn)生核值，這稱為化學(xué)位移的歸屬(或指認(rèn)化學(xué)位移的歸屬是通過對一系列核磁譜圖的來獲得的，分為主鏈和側(cè)鏈化學(xué)位移歸屬兩 主鏈化學(xué)位移歸屬是指獲得蛋白質(zhì)肽鏈骨架上各原子(包括15N1HN13化學(xué)位移的歸屬是通過對一系列核磁譜圖的來獲得的，分為主鏈和側(cè)鏈化學(xué)位移歸屬兩 主鏈化學(xué)位移歸屬是指獲得蛋白質(zhì)肽鏈骨架上各原子(包括15N1HN13CO13C和1H側(cè)鏈化學(xué)位移歸屬的目的在于獲得各個氨基酸殘基側(cè)常用于蛋白質(zhì)溶液結(jié)構(gòu)計算的結(jié)構(gòu)約束主要包括NOE，二面角，氫常用于蛋白質(zhì)溶液結(jié)構(gòu)計算的結(jié)構(gòu)約束主要包括NOE，二面角，氫鍵，以及殘余偶極耦合(Residual

7、Dipolar Couplings , RDC) NOE效應(yīng)是指兩個空間距離相近的原子通過空次間進行磁矩傳遞，該效應(yīng)的強度與距離的角度約束最常用的是主鏈肽鍵的二面角和 氫鍵的約束傳統(tǒng)上依靠蛋白質(zhì)在重水中主鏈酰胺基的氫氘交換實驗，同時結(jié)合觀察到的初始結(jié)構(gòu)的生初始結(jié)構(gòu)的生NOE 信號歸結(jié)構(gòu)計結(jié)構(gòu)精蛋白質(zhì)分子在溶液中的運動包括了分子的整體動運動，其中運動又可以分為在快速時間尺度(蛋白質(zhì)分子在溶液中的運動包括了分子的整體動運動，其中運動又可以分為在快速時間尺度(皮秒)的運動以及慢時間尺度(毫秒)的構(gòu)象(或化學(xué))交換 尤其是慢時間尺度的構(gòu)象交換，它與許多重要的生物過程，如酶催化、蛋白質(zhì)折疊和蛋白，發(fā)生在

8、同一時間尺度內(nèi)，和蛋白質(zhì)的生物功能有著核磁信號的弛豫參數(shù)包含了蛋白質(zhì)分子運動的信息，可以作為探針來獲得蛋白質(zhì)分子的動力核磁信號的弛豫參數(shù)包含了蛋白質(zhì)分子運動的信息，可以作為探針來獲得蛋白質(zhì)分子的動力縱向弛豫速率三維冷凍電鏡技術(shù)主要是將樣品保存在液氮或液氦溫度下利用透射電子三維冷凍電鏡技術(shù)主要是將樣品保存在液氮或液氦溫度下利用透射電子顯微鏡進行二維成像，再經(jīng)過對二維投影圖像的分析將樣品通過快速液氮冷凍“凍”在玻璃態(tài)冰中金屬鹽中，圖像具有很高的對比度，而且樣品在結(jié)合圖像分類技術(shù)，該方法可以用于研究非常不均一或者分子量較小的樣品然而染色過程不可避免地會引起樣品的變形且有染色不均勻的缺陷，所以負染樣品

9、的精度通金屬鹽中，圖像具有很高的對比度，而且樣品在結(jié)合圖像分類技術(shù)，該方法可以用于研究非常不均一或者分子量較小的樣品然而染色過程不可避免地會引起樣品的變形且有染色不均勻的缺陷，所以負染樣品的精度通常不超過20 通過快速冷凍的制樣方法，能夠使樣品處在接近ice)中，從而保持其天然構(gòu)像，克服了染色等過程對樣品構(gòu)象的影結(jié)構(gòu)更接近功能活性狀態(tài)但是冷凍電鏡的圖像對比度和信噪比很低，并且樣品的朝通過快速冷凍的制樣方法，能夠使樣品處在接近ice)中，從而保持其天然構(gòu)像，克服了染色等過程對樣品構(gòu)象的影結(jié)構(gòu)更接近功能活性狀態(tài)但是冷凍電鏡的圖像對比度和信噪比很低，并且樣品的朝雜亂機的heterogeneity)，

10、需要復(fù)合大量單顆粒圖像來提高因而不適合研究不均一或者分子量較小的樣品方法可以使樣品處于生理狀態(tài)的環(huán)境，并且具有RNA聚合酶、TFIIE及RNA 方法可以使樣品處于生理狀態(tài)的環(huán)境，并且具有RNA聚合酶、TFIIE及RNA 10g10g/晶體結(jié)構(gòu)Backbone 晶體結(jié)構(gòu)Backbone 尺度的電子密度不均勻區(qū)，則會在入射光束周圍的小角度范圍內(nèi)（尺度的電子密度不均勻區(qū)，則會在入射光束周圍的小角度范圍內(nèi)（一般04）出現(xiàn)散射X射線， 小角X 小角X射線散射(smallangleXrayscattering 小角中子散射(smallangleneutronscatteringSAXS譜圖能直接提供的參數(shù)只能給出粒子結(jié)構(gòu)的分子質(zhì)量SAXS譜圖能直接提供的參數(shù)只能給出粒子結(jié)構(gòu)的分子質(zhì)量 對于大的蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)復(fù)合物，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)各結(jié)構(gòu)域或亞基的結(jié)構(gòu)已知時，SAXS