多克隆抗體的制備及抗體效價(jià)測(cè)定課件

1、多克隆抗體的制備及抗體效價(jià)測(cè)定 目的要求掌握多克隆抗體制備的基本原理。掌握多克隆抗體制備的操作步驟。掌握肥達(dá)反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)原理、操作流程和結(jié)果判斷。熟悉ELISA的實(shí)驗(yàn)原理、操作流程和結(jié)果判斷。了解細(xì)菌抗原和病毒抗原免疫程序上的異同。了解免疫動(dòng)物的選擇原則。原理1、克隆(clone)： 是指無性繁殖細(xì)胞系，是由單一個(gè)祖先細(xì)胞分裂繁殖而形成的一簇細(xì)胞純系。在這個(gè)家族的所有成員中，如無突變發(fā)生，其基因是完全相同的。2、多克隆抗體（polyclonal antibody, pAb）：用一種包含多種抗原決定簇的抗原免疫動(dòng)物，可刺激機(jī)體多個(gè)B細(xì)胞克隆產(chǎn)生針對(duì)多種抗原表位的不同抗體。所獲得的免疫血清實(shí)際上是含

2、有多種抗體的混合物，即多克隆抗體。 3、單克隆抗體（monoclonal antibodies, mAb）：由一個(gè)識(shí)別一種抗原表位的B細(xì)胞克隆產(chǎn)生的同源抗體。高度均一、特異性強(qiáng)、效價(jià)高、少或無交叉反應(yīng)性。Ab1Ab3Ab4單克隆抗體抗原Ab1抗血清Ab1Ab2Ab3Ab4Ab2Ab3Ab4普通抗血清（多克隆抗體）脾B細(xì)胞骨髓瘤小鼠取腹水骨髓瘤細(xì)胞HAT培養(yǎng)，稀釋單克隆抗體和多克隆抗體產(chǎn)生區(qū)別示意圖雜交瘤細(xì)胞+ PEG, 融合Ab2 多克隆抗體制備流程（一）免疫原的制備（二）免疫動(dòng)物（三）免疫血清的收集（四）免疫血清的鑒定（五）免疫血清的保存（一）細(xì)胞性抗原制備： 綿羊紅細(xì)胞（SRBC）- 溶血

3、素； 細(xì)菌- 抗菌抗體（動(dòng)物免疫血清）（二）可溶性抗原制備： 指蛋白質(zhì)、多糖和脂類等。1）細(xì)胞的破碎（物理法、化學(xué)法）反復(fù)凍融法超聲破碎法自溶法酶處里法表面活性劑處理法2）提取與純化：超速離心分離是一種根據(jù)分離物質(zhì)的比重特點(diǎn)，通過差速或梯度密度離心，將分子大小不同的抗原顆粒分開的方法，只適宜少數(shù)大分子物質(zhì)的分離。選擇性沉淀選擇某抗原理化特性，采用相應(yīng)沉淀劑或溶液環(huán)境。 核酸去除 鹽析沉淀法 有機(jī)溶劑沉淀法 高分子聚合物沉淀法例： 50%飽和硫酸銨鹽溶液可沉淀析出學(xué)清球蛋； 8%12%PEG6000可沉淀IgG。 鹽析法沉淀抗原的機(jī)理 超濾法利用孔徑大小不同的特制薄膜對(duì)不同分子大小的抗原物質(zhì)進(jìn)行

4、濾篩。層析法 凝膠過濾 離子交換 親和層析電泳（略） 親和層析的作用機(jī)理3）鑒定： 鑒定純化蛋白的含量、相對(duì)分子的質(zhì)量、 純度以及免疫學(xué)活性。蛋白的含量定氮（紫外光280nm等）分子的質(zhì)量電泳、質(zhì)譜蛋白的純度電泳等免疫學(xué)活性免疫雙擴(kuò)散、免疫印跡（三）半抗原性免疫原的制備1.載體選擇常用載體：蛋白質(zhì)、多肽聚合物、大分子聚合物。（1）蛋白質(zhì)類：常用的有人血清白蛋白、牛血清白蛋白、血蛋白等，其中以牛血清白蛋白最為常用。（2）多肽類聚合物：是由人工合成的多肽聚合物，也是一類良好的載體，常用的有多聚賴氨酸。（3）大分子聚合物：聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、羧甲基纖維素(CMC)等皆可與半抗原結(jié)合，加入福氏完

5、全佐劑可誘導(dǎo)動(dòng)物產(chǎn)生良好的抗體。2.連接方法 半抗原與載體的連接有物理法和化學(xué)法。物理法 是用物理吸附法將載體與半抗原連接，其原理是通過電荷和微孔來吸半抗原，吸附載體主要有PVP和CMC等；化學(xué)法 是利用某些功能基團(tuán)把半抗原連接到白質(zhì)類或多肽類聚合物載體上。不同的半抗原應(yīng)選用不同的方法進(jìn)行連接。 根據(jù)半抗原擁有的化學(xué)基團(tuán)不同，連接方法主要有以下幾類：帶游離氨基或羧基以及二種基團(tuán)皆有的半抗原：羧基可用混合酸酐法和碳二亞胺法與載體氨基形成穩(wěn)定的肽鍵，帶氨基的半抗原則可與載體羧基縮合。帶有羥基、酮基、醛基的半抗原：不能直接與載體連接，需要用化學(xué)方法如琥珀酸酐法、O-（羧甲基）羥胺法等方法將之轉(zhuǎn)變?yōu)閹?/p>

6、有羧基的半抗原衍生物后才能與載體連接。帶有酚基的半抗原，可用一氯醋酸鈉法或重氮化的對(duì)氨基苯甲酸法，生成帶有羧基的半抗原衍生物。（四）免疫佐劑某些物質(zhì)與抗原一起或先于抗原注入機(jī)體，可增強(qiáng)機(jī)體對(duì)該抗原的特異性免疫應(yīng)答或改變免疫應(yīng)答類型，此類物質(zhì)稱為免疫佐劑(immunoadjuvant)，簡稱佐劑。 佐劑的種類 佐劑一般包括以下幾類：無機(jī)佐劑： 如氫氧化鋁、明釩等生物性佐劑： 如結(jié)核分枝桿菌、卡介苗、小棒狀桿菌、百日咳桿菌、革蘭陰性桿菌內(nèi)毒素、霍亂毒素的B亞單位、胞壁酰二肽和細(xì)胞因子等；人工合成佐劑： 如雙鏈多聚肌苷酸：胞苷酸（poly I：C）、雙鏈多聚腺苷酸：尿苷酸（poly A：U）；油劑：

7、如弗氏完全佐劑、花生油乳劑等；納米佐劑 弗氏佐劑（Freunds adjuvant）,分為弗氏不完全佐劑和完全佐劑兩種：前者是由油劑（礦物油或花生油）和乳化劑（羊毛脂或吐溫-80）按1：11：5比例混合而成；后者由弗氏不完全佐劑加卡介苗組成。在免疫動(dòng)物時(shí)，先將弗氏佐劑與抗原等比混勻，制成“油包水”乳化液。 2. 佐劑的免疫生物學(xué)作用增強(qiáng)抗原免疫原性：使無或微弱免疫原性的物質(zhì)變成持久或強(qiáng)的免疫原；增強(qiáng)機(jī)體對(duì)抗原刺激的反應(yīng)性，提高初次應(yīng)答和再次應(yīng)答所產(chǎn)生的抗體滴度；改變抗體類型，使產(chǎn)生抗體由IgMG型轉(zhuǎn)變?yōu)镮gG型；引起或增強(qiáng)遲發(fā)性超敏反應(yīng)。3. 佐劑的作用機(jī)制 佐劑的作用機(jī)制歸納起來主要有如下幾

8、種：可增強(qiáng)抗原的表面積和改變抗原活性基團(tuán)構(gòu)型，從而增強(qiáng)抗原的免疫原性。佐劑與抗原混合一起注入機(jī)體，可改變抗原的物理性狀，形成抗原儲(chǔ)存庫，延長抗原在局部組織的滯留時(shí)間，有利于抗原的緩慢釋放。增強(qiáng)吞噬細(xì)胞的吞噬作用（被佐劑吸附的抗原易被吞噬細(xì)胞吞噬），促進(jìn)對(duì)抗原的處理，刺激淋巴細(xì)胞增生，從而增強(qiáng)和擴(kuò)大免疫應(yīng)答的效應(yīng)。 （二）免疫方法 選定動(dòng)物后，在免疫過程中應(yīng)考慮免疫劑量、免疫途徑、免疫次數(shù)、免疫間隔等因素。 (1) 免疫原的劑量：免疫原的接種劑量按免疫原性的強(qiáng)弱、動(dòng)物的個(gè)體狀態(tài)和免疫時(shí)間來確定。首次免疫時(shí)，劑量不宜過大，以免產(chǎn)生免疫麻痹。 (2) 免疫途徑與免疫間隔時(shí)間免疫途徑通常有皮內(nèi)、皮下、

9、肌肉、靜脈、腹腔、淋巴結(jié)等，視不同的免疫方案而異。對(duì)于不易獲取的寶貴抗原可采用淋巴結(jié)免疫法。 免疫間隔時(shí)間是影響抗體產(chǎn)生的重要因素，其中首次與第二次免疫的間隔時(shí)間尤為重要，一般以1020天為佳，二次后間隔時(shí)間一般為710天，若間隔時(shí)間太長，則刺激減弱，抗體效價(jià)不高。 常規(guī)制備痢疾致賀菌、傷寒桿菌抗血清的免疫方案 日期（天）16/711/1416/2121/2726/34途徑皮內(nèi)靜脈靜脈靜脈靜脈靜脈抗原熱殺死菌熱殺死菌活菌活菌活菌活菌劑量（mL）1.00.50.20.51.02.0常規(guī)制備NDV、VSV抗血清的免疫方案日期（天）16/711/1416/2121/2726/34途徑皮內(nèi)靜脈靜脈靜脈

10、靜脈靜脈抗原弗氏完全佐劑 單純抗原單純抗原單純抗原單純抗原單純抗原劑量（mL）1.00.50.20.51.02.0三、動(dòng)物采血采集免疫血清前，要預(yù)先測(cè)試抗體效價(jià)測(cè)定，若效價(jià)達(dá)到要求，應(yīng)在末次免疫后一周及時(shí)采血，否則抗體效價(jià)會(huì)下降。 (1) 頸動(dòng)脈采血法 (2)心臟采血法 (3)靜脈采血法 頸動(dòng)脈分離圖 四、免疫血清的鑒定1. 效價(jià)的測(cè)定：顆粒性抗原可采用凝集試驗(yàn)，可溶性抗原常用雙向免疫擴(kuò)散試驗(yàn)、ELISA等方法。玻片凝集試驗(yàn)肥達(dá)試驗(yàn)（微量法）：(Widals test )ELISA 肥達(dá)試驗(yàn)（Widal test）是用已知的傷寒桿菌O、H抗原和甲、乙型副傷寒桿菌H抗原與病人血清做定量凝集試驗(yàn)，

11、以測(cè)定患者血清中有無相應(yīng)抗體，根據(jù)抗體含量的多少以及增長情況，可幫助診斷傷寒及副傷寒。 【原理】 1抗原：傷寒桿菌“O”、“H”及甲、乙型副傷寒菌液。 2待檢血清（須經(jīng)5630min滅活）。 3生理鹽水、24孔細(xì)胞反應(yīng)板、中號(hào)試管、吸管、水浴箱等。【材料】 1取小號(hào)試管1支，加生理鹽水3.8ml，用吸管吸取患者血清0.2ml加入其中混勻，即為1：20稀釋血清，總量為4ml。 2取1塊24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每排第1孔分別標(biāo)上“O”、“H”、“PA”、“PB”符號(hào)。 3. 第1排第2孔至第5孔各加0.4 mL生理鹽水。每排第6孔為對(duì)照孔，各加生理鹽水0.1mL。 【操作步驟】 4. 第1排第2孔至第5

12、孔各加0.4 mL生理鹽水。每排第6孔為對(duì)照孔，各加生理鹽水0.1mL。 5. 每排第1孔各加1：20的血清0.1 mL。 6. 第1排的第2孔加1：20的血清0.4 mL，從第2孔開始按倍比稀釋法稀釋血清，即第2孔吹吸混勻后取0.4 mL至第3孔，再從第2孔依次取0.1mL至第2、3、4排的第2孔，第3孔混勻后取0.4以此類推直至第5孔孔，從第5孔棄去0.4mL。 這樣各排第1孔至第5孔的血清稀釋度為1：20、1：40、1：80、1：160、1：320。 6. 按H、O、PA、PB標(biāo)記符號(hào)，第1排1-5孔加入“O”型傷寒桿菌實(shí)驗(yàn)菌液，第2排各孔加入“H”型傷寒桿菌實(shí)驗(yàn)菌液，第3排加入甲型副傷

13、寒桿菌實(shí)驗(yàn)菌液，第4排加入乙型副傷寒桿菌實(shí)驗(yàn)菌液，每孔均加入實(shí)驗(yàn)菌液0.1mL。 7. 輕輕振搖反應(yīng)板，使其混勻，置37恒溫箱23小時(shí)觀察結(jié)果。 肥達(dá)反應(yīng)稀釋法示意表試驗(yàn)管（每管0.2ml） 對(duì)照管 123456血清稀釋度1:201:401:801:1601:320（NS 0.5ml） 1“O”抗原 0.20.20.20.20.20.22“H”抗原0.20.20.20.20.20.23PA抗原0.20.20.20.20.20.24PB抗原0.20.20.20.20.20.2血清最終稀釋度 1:401:801:1601:3201:640-【結(jié)果】 各孔凝集程度的判斷以肉眼可見：孔內(nèi)上清液完全清亮

14、，細(xì)菌全部形成凝塊記為“+ + + +”；孔內(nèi)上清液透明度達(dá)75%，大部分細(xì)菌形成明顯可見的凝集塊為“+ + +”；孔內(nèi)上清液透明度達(dá)50%，約50%細(xì)菌形成明顯可見的凝集塊為“+ +”；孔內(nèi)上清液透明度只達(dá)25%；僅有小部分細(xì)菌形成小凝塊為“+”，孔內(nèi)液體均為混濁；無凝集塊，細(xì)菌沉于孔底呈白色圓點(diǎn)狀，邊緣清晰為“”。（圖示）肥達(dá)反應(yīng)結(jié)果圖 血清的凝集效價(jià)（滴度）：是指能與一定量的抗原發(fā)生肉眼可見的明顯凝集（即“+”凝集）的血清最高稀釋倍數(shù)。血清效價(jià)代表血清中抗體的含量，血清效價(jià)越高，所含抗體的量愈多。一般認(rèn)為，傷寒沙門菌“O”抗體凝集效價(jià)在1：80以上，“H”抗體在1：160以上，甲、乙型副

15、傷寒沙門菌凝集效價(jià)在1：80以上才有診斷價(jià)值。操作步驟ELISA2. 特異性的鑒定：抗體特異性鑒定常用雙向免疫擴(kuò)散法、免疫電泳法3. 純度的鑒定： 抗體純度的鑒定可采用SDS-聚丙酰胺凝膠電泳（SDS）、雙向擴(kuò)散試驗(yàn)、免疫電泳等方法。 IgG含有重鏈和輕鏈，純IgG的SDS結(jié)果應(yīng)有兩條蛋白電泳帶（分子量約53kD和22kD），若出現(xiàn)多條電泳帶則表明制備的抗體混有雜蛋白，需進(jìn)一步純化。4. 親和力的鑒定：測(cè)定抗體親力的方法較多，如平衡透析法、ELISA或RIA競爭結(jié)合試驗(yàn)等。單抗親合常數(shù)的測(cè)定：單抗親合常數(shù)測(cè)定采用非競爭酶免疫試驗(yàn)法：1）先確定在某一抗原濃度時(shí)抗體可以達(dá)到飽和；2）以該抗原濃度為實(shí)驗(yàn)條件，飽和時(shí)的OD值作為OD-100，找出OD-50時(shí)的抗體濃度和相應(yīng)的pp65抗原