細(xì)胞毒性試驗(yàn)總結(jié)

1、細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)總結(jié) TOC o 1-5 h z HYPERLINK l bookmark2 o Current Document 抗HBV藥物細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)背景知識 1 HYPERLINK l bookmark4 o Current Document 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)方案的確立 3 HYPERLINK l bookmark6 o Current Document 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)方法穩(wěn)定后的部分?jǐn)?shù)據(jù) 4 HYPERLINK l bookmark8 o Current Document 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)質(zhì)量評價(jià)指標(biāo) 5 HYPERLINK l bookmark10 o Current Document 細(xì)胞毒性

2、實(shí)驗(yàn) SOP6（一）目的6 HYPERLINK l bookmark15 o Current Document （二）適用范圍6 HYPERLINK l bookmark17 o Current Document （三）責(zé)任人6 HYPERLINK l bookmark19 o Current Document （四）規(guī) 程6試驗(yàn)準(zhǔn)備7試驗(yàn)操作8數(shù)據(jù)處理和分析8 HYPERLINK l bookmark21 o Current Document 總結(jié)9一、 抗HBV藥物細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)背景知識細(xì)胞毒性是化學(xué)物質(zhì)（藥物）作用于細(xì)胞基本結(jié)構(gòu)和/或生理過程，如細(xì)胞膜或細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)，細(xì)胞的新陳代謝過程，細(xì)

3、胞組分或產(chǎn)物的合成、降解或釋放，離子調(diào)控及細(xì)胞分裂等過程， 導(dǎo)致細(xì)胞存活、增殖和/或功能的紊亂，所引發(fā)的不良反應(yīng)。按作用機(jī)制可分3種類型：基本細(xì)胞毒性，涉及一種或多種上述結(jié)構(gòu)或功能的改變，作用于所有類型的細(xì)胞；選擇細(xì)胞毒性， 存在于某些分化細(xì)胞上，主要通過化學(xué)物質(zhì)的生物轉(zhuǎn)化，與特殊受體結(jié)合或特殊的攝入機(jī)制所 引發(fā)；細(xì)胞特殊功能毒性，對細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能損傷輕微，但對整個(gè)機(jī)體損傷非常嚴(yán)重。類似 毒性作用可通過細(xì)胞因子、激素和遞質(zhì)的合成、釋放、結(jié)合和降解影響細(xì)胞與細(xì)胞間的交流或 特殊的轉(zhuǎn)運(yùn)過程而實(shí)現(xiàn)。毒性作用也可能來自化學(xué)物質(zhì)對細(xì)胞外過程的干擾，任何一種非動(dòng)物檢測系統(tǒng)對多種因素都應(yīng)加以考慮。1983年

4、Ekwall提出 基本細(xì)胞功能”的概念，即多數(shù)化學(xué)物質(zhì)毒性作用是對細(xì)胞功能的非特異性損傷，卻可引起器官功能的特異性改變甚至機(jī)體死亡。有 研究顯示化學(xué)物質(zhì)體外細(xì)胞毒性與其引起的動(dòng)物死亡率及人體死亡的血藥濃度之間都存在良好 的相關(guān)性?；瘜W(xué)物質(zhì)產(chǎn)生的損傷和死亡，最終可表現(xiàn)為細(xì)胞水平上的改變，由此推測體外細(xì)胞 毒性可以預(yù)測體內(nèi)急性毒性。體外方法有助于預(yù)測化學(xué)物質(zhì)急性暴露引發(fā)的全身和局部影響， 并評估體內(nèi)毒性濃度。目前較為理想的抗 HBV藥物有拉米夫定（3TC）、恩替卡韋（ETV）等。3TC是核昔左旋 對味體，早期用于艾滋病的治療。 拉米夫定體外能才制艾滋病毒1、2型及乙型肝炎病毒逆轉(zhuǎn)錄酶，在人淋巴細(xì)胞

5、和單核細(xì)胞內(nèi)抑制艾滋病毒逆轉(zhuǎn)錄酶活性，在 HBV-DNA轉(zhuǎn)染的人肝癌細(xì)胞 內(nèi)有抑制HBV-DNA復(fù)制，在HBV感染黑猩猩體內(nèi)有抑制病毒作用。拉米夫定作用原理是藥物進(jìn)入細(xì)胞器，為細(xì)胞脫氧胞喀咤激酶和細(xì)胞激酶磷酸化為活性5-三磷酸拉米夫定，競爭性抑制依賴于病毒 DNA和RNA逆轉(zhuǎn)錄酶。恩替卡韋（ETV）為環(huán)氧羥碳脫氧鳥昔，具有較強(qiáng)的抗 HBV作用，也可抑制拉米夫定引起的YMDD變異病毒株感染。在體外應(yīng)用HBV DNA轉(zhuǎn)染的HepG2細(xì)胞作藥敏試驗(yàn)， 結(jié)果該藥抗HBV作用最強(qiáng)。恩替卡韋？拉米夫定？泛昔洛韋抑制 HBV 的半數(shù)有效濃度（EC50）分別為0.00375 mol/L 0.116科mol/L

6、（文獻(xiàn)報(bào)道多在幾 nM到幾個(gè) 眼, 范圍較寬）、100科mol/L在土撥鼠肝炎病毒（ WHV）感染的土撥鼠動(dòng)物模型，口服恩替卡韋 0.1 mg/kg.d共12周，血清 WHV轉(zhuǎn)陰。以后，每周口服 0.1 mg/kg ,血清 WHV仍維持陰性。因 此3TC和ETV常被用作抗HBV藥物篩選時(shí)的陽性對照藥，用來評價(jià)篩選系統(tǒng)的正常與否。3TCETV通常的做法是：將不同濃度的3TC加入到培養(yǎng)的細(xì)胞中，作用一定時(shí)間后檢測藥物對細(xì)胞的毒性。檢測方法有 MTT法、XTT法、熒光檢測法等。其中 MTT法和XTT法原理相同，由 于其方法簡單快速，不需特殊的儀器設(shè)備，因此得到了廣泛應(yīng)用。MTT法是二十世紀(jì)八十年代發(fā)

7、展起來的一種快速、簡便的測試方法，目前已被廣泛用于藥物體外篩選實(shí)驗(yàn)。MTT法是一種檢測細(xì)胞活性的方法。與以往細(xì)胞水平研究中檢測細(xì)胞活性的兩種常規(guī)方法-細(xì)胞計(jì)數(shù)法和同位素?fù)饺敕ㄏ啾?，MTT法具有操作簡便、快速、準(zhǔn)確、廉價(jià)及不使用同位素等優(yōu)點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)的諸多領(lǐng)域。同時(shí)，MTT法也是FDA及我國藥品審批部門推薦的檢測方法之一。其基本原理如下：活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能夠還原黃色的澳化3-（4,5- 二甲基曝陛-2）-2,5- 二苯基四氮陛3-（4,5-dimethylthiazol-2yl）-2,5-diphenylterazolium bromide , MTT為藍(lán)紫色的不溶于水的

8、甲月贊（formazan）,甲月贊的生成量在通常情況下與活細(xì)胞數(shù)成正比。由于甲月費(fèi)的多少可通過酶標(biāo)儀測定其在570nm處的吸光度（OD值）而得知，因此可根據(jù)OD值推測出活細(xì)胞的數(shù)目，從而了解藥物抑制或殺傷細(xì)胞的能力。目前已有 MTT的升級替代產(chǎn)品，如 XTT、MTS、WST-8等，三種方法的比較見下表。盡管CCK-8方法簡便、準(zhǔn)確、靈敏度高，但比MTT的價(jià)格要貴不少，所以一般來說，還是 MTT法用的多。三種方法的比較MTT法XTT法CCK-8 法（WST-8法）甲月贊水溶性難溶性水溶性水溶性檢測波長490 nm450nm450nm性狀粉末2瓶溶液1瓶溶液使用方法配成溶液后使用現(xiàn)配現(xiàn)用毋需頂制使

9、用有機(jī)溶劑DMS誠其它溶劑一一方便性+檢測速度+重復(fù)性+穩(wěn)定性+工作量-對細(xì)胞毒性-對人體毒性一-二、細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)方案的確立在確定MTT法作為細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)的方法之后， 我們對實(shí)驗(yàn)中可能涉及的各個(gè)參數(shù)進(jìn)行了摸 索和優(yōu)化。最初，由于一切都是未知，因此常常幾個(gè)參數(shù)一起調(diào)整，使得各個(gè)參數(shù)對結(jié)果的影 響不是很清楚，走了一些彎路。后期逐漸摸清了參數(shù)對結(jié)果影響的權(quán)重，實(shí)驗(yàn)方案逐步確立。考慮的實(shí)驗(yàn)參數(shù)有： 細(xì)胞批次、細(xì)胞密度、孵育時(shí)間、加藥次數(shù)、MTT量、MTT孵育時(shí) 間、DMSO溶解時(shí)間（振蕩時(shí)間）等 。parameterCC50cell density2000/well, 5000/well, 10000

10、/well,40000/wellseeding time1d/2dincubation time7d/10dFBS10%, 2%, 0.5%volume100 山 150d , 180 d經(jīng)過實(shí)驗(yàn)，最終將實(shí)驗(yàn)參數(shù)確定如下:parameterCC50cell density5000/wellseeding time1dincubation time7dFBS2%volume1804其中，孵育時(shí)間采用 7天，主要是希望縮短篩選周期，10天也取得了較好的結(jié)果。培養(yǎng)基體積對結(jié)果影響不大。采用180 M主要是和DNA增殖抑制實(shí)驗(yàn)保持一致。三、細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)方法穩(wěn)定后的部分?jǐn)?shù)據(jù)在細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)方案穩(wěn)定之后，在

11、各孔吸光度的標(biāo)準(zhǔn)差、變異系數(shù)和各孔抑制率的標(biāo)準(zhǔn)差 都可以控制在很低的水平，表明該實(shí)驗(yàn)方案是穩(wěn)定的，具有良好的重現(xiàn)性。Date:09/07/07compound: ETV cell density:5x103 incubation time: 7 drug adding:2 times2%FBS180ul1# plateCC50= 40.4uMConc.(uM)Date:09/07/07compound: ETV cell density:5x103 incubation time: 7 drug adding:2 times2%FBS180ul1# plateCC50= 40.4uMConc.

12、(uM)value1value2value3MeanSTDEV%CV% Viability%STDEV20020.2150.0178.01911.6410.1601000.3690.0215.73620.0110.493500.8580.0252.91146.5292.720251.2270.13510.96766.5409.9491.4800.0674.50480.2780.3201.6200.0684.17987.8340.0511.7400.0522.98994.3420.05701.8440.0422.251100.0000.000典型ETV的CC50實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)0.25 0.5 I 2

13、J r IB 那國 12S 期 M2 1口？4 的43ETV (UM)典型3TC的CC50實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)Date:09/07/07compound: 3TC cell density:5x103 incubation time: 7 drug adding:2 times2%FBS180ul2#plateCC50= 2130uMConc.(uM)value1value2Date:09/07/07compound: 3TC cell density:5x103 incubation time: 7 drug adding:2 times2%FBS180ul2#plateCC50= 2130uMConc

14、.(uM)value1value2value3MeanSTDEV%CV% Viability%STDEV80000.2090.03918.81511.7961.9024000720.0193.23832.3351.73920000.8420.0505.99447.5984.99010001.3070.0151.11173.8843.0565001.5880.0342.16689.7684.9662501.6480.0090.52993.1602.7951251.7100.0613.57196.6460.24101.7690.0170.934100.0000.000川SOcompound 3TC

15、 cell density 5x103 Incubation lime 7 drug addin* times 2% FBSrate=i CC50=2i30uM3254126250512 1QZ4 204-6 40915 192 16334 327003TC uM四、細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)質(zhì)量評價(jià)指標(biāo)對細(xì)胞毒性進(jìn)行質(zhì)量評價(jià)白指標(biāo)初步定為以下7個(gè)：. OD平均值：反映復(fù)孔間 OD值的平均水平，OD值越大，細(xì)胞數(shù)越多。.復(fù)孔OD值間的標(biāo)準(zhǔn)差（STDEV）:反映各復(fù)孔 OD值之間的離散情況。標(biāo)準(zhǔn)差越大， 說明復(fù)孔間不平行性越大，操作誤差越大。.復(fù)孔OD值間的變異系數(shù)（CV）:也是反映復(fù)孔間 OD值離散情況的指

16、標(biāo)。由于 OD 值間的標(biāo)準(zhǔn)差（STDEV ）的單位和OD的單位是一致的，不能體現(xiàn)離散的權(quán)重，因此 引入變異系數(shù)（CV）。這一指標(biāo)以百分比的形式表現(xiàn)OD值的離散情況，形象、直觀。.存活率（% Viability ）：計(jì)算各藥物濃度下細(xì)胞的存活率可以反映細(xì)胞存活情況，該值 越大，說明藥物的細(xì)胞毒性作用越小。.存活率的標(biāo)準(zhǔn)差（ STDEV ）:該值反映如以每個(gè)復(fù)孔均作為單獨(dú)的實(shí)驗(yàn)，則同批的 復(fù)孔可以看作數(shù)批實(shí)驗(yàn)， 此時(shí)存活率的分布情況。 該指標(biāo)越大，說明復(fù)孔間越不平行。.存活率的變異系數(shù)（ CV）:該指標(biāo)反映各復(fù)孔間存活率的離散情況，該值越大，說明說明每一列細(xì)胞孔（即一系列稀釋單孔）間不平行性越大。

17、. 半數(shù)致細(xì)胞毒性濃度（concentration of cytotoxicity 50% , 0050）:指對半數(shù)細(xì)胞產(chǎn)生 毒性作用所需濃度。該指標(biāo)可用來反映實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)是否正常工作及評價(jià)未知藥物對細(xì)胞 的毒性。五、細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)SOP化合物抗HBV活性細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程（MTT法）（一）目的使實(shí)驗(yàn)操作標(biāo)準(zhǔn)化，保證正常工作的進(jìn)行。（二）適用范圍本標(biāo)準(zhǔn)適用于 MTT法檢測抗HBV藥物細(xì)胞毒性的操作及計(jì)算0050 o（三）責(zé)任人分子生物學(xué)組操作人員對本規(guī)程負(fù)責(zé)。（四）規(guī)程術(shù)語：0050 （ concentration of cytotoxicity 50 %）:半數(shù)細(xì)胞毒性濃度，指對半數(shù)細(xì)胞產(chǎn)生

18、毒性作 用所需濃度。在本實(shí)驗(yàn)中，指致50%細(xì)胞死亡所需的藥物濃度。本實(shí)驗(yàn)旨在通過 MTT法檢測未知化合物對轉(zhuǎn)染了HBV基因組的細(xì)胞系HepG的細(xì)胞毒性。背景知識：MTT法是二十世紀(jì)八十年代發(fā)展起來的一種快速、簡便的測試方法，目前已被廣泛用于藥物體外篩選實(shí)驗(yàn)。其基本原理如下：活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能夠還原黃色的澳化3-（4,5-二甲基曝口坐-2）-2,5-二苯基四氮口坐3-（4,5-dimethylthiazol-2yl）-2,5-diphenylterazolium bromide, MTT為藍(lán)紫色的不溶于水的甲月贊（formazan）,甲月贊的生成量在通常情況下與活細(xì)胞數(shù)成正比。由于甲

19、月費(fèi)的多少可通過酶標(biāo)儀測定其在570nm處的吸光度（OD值）而得知，因此可根據(jù) OD值推測出活細(xì)胞的數(shù)目，了解藥物抑制或殺傷細(xì)胞的能力。MTT法是一種檢測細(xì)胞活性的方法。與以往細(xì)胞水平研究中檢測細(xì)胞活性的兩種常規(guī)方法-細(xì)胞計(jì)數(shù)法和同位素?fù)饺敕ㄏ啾?，MTT法具有操作簡便、快速、準(zhǔn)確、廉價(jià)及不使用同位素等優(yōu)點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)的諸多領(lǐng)域。同時(shí)， MTT法也是FDA及我國藥品審批部門推薦 的檢測方法之一。試驗(yàn)準(zhǔn)備試劑和耗材：試劑：胎牛血清（FBS） ; G418; DMEM 培養(yǎng)基（高糖）； 0.25%Trypsin-EDTA ;磷酸 鹽緩沖液（無車鎂）； DMSO ;耗材：0.2針頭過濾器（有

20、機(jī)相和水相）；1 ml和10 ml注射器；96孔細(xì)胞培養(yǎng)板；移液管（5 ml、10 ml）;移液器Tip頭。溶液配制：完全培養(yǎng)基：DMEM和FBS按9 ： 1 （體積比）混和，并添加1/1001/50 （體積比）的hepes 和終濃度為380回/ml的G418。維持培養(yǎng)基：DMEM和FBS按49： 1 （體積比）混和，并添加 1/1001/50 （體積比）的 hepe環(huán)口終濃度為3800ml的G418。磷酸鹽緩沖液（無鈣、鎂）：8 g/L NaCl ,0.2 g/L KCl , 1.44 g/L Na2HPO4, 0.24 g/L KH 2P。4, pH7.4,高壓蒸汽滅菌121c 20 mi

21、n, 4c保存。（注意：實(shí)際配制時(shí)，有些試劑含多個(gè) 分子的水，需將該部分的質(zhì)量算進(jìn)去。）細(xì)胞培養(yǎng)：HepG培養(yǎng)采用完全培養(yǎng)基，于 37 C, 5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。接種時(shí)，細(xì)胞 密度控制在1X105/ml2X105/ml左右。細(xì)胞計(jì)數(shù)：見附件細(xì)胞計(jì)數(shù)。細(xì)胞鋪板：細(xì)胞計(jì)數(shù)后，用完全培養(yǎng)基稀釋成M04 ml,在5%CO2, 37c培養(yǎng)24 h備用。注意：在向96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中接種細(xì)胞時(shí)，應(yīng)注意每次吸取細(xì)胞懸液前，都應(yīng)輕輕搖勻，盡量減少每次吸取的細(xì)胞數(shù)目的差異。將藥物用少量DMSO溶解，并用0.2科訂次性針頭過濾器（有機(jī)系）過濾除菌，此為母液 （其濃度通常為預(yù)先設(shè)計(jì)的最高待測濃度的1000倍或以

22、上）；然后用維持培養(yǎng)基將母液稀釋到實(shí)驗(yàn)預(yù)先設(shè)計(jì)的最高待測濃度。如配制的母液體積過?。ㄈ绲陀? ml）,不便于過濾，可先用完全培養(yǎng)基將其稀釋到最高待測濃度，再用0.2科廠次性針頭過濾器（水系）過濾后分裝備用。試驗(yàn)操作藥物稀釋：藥物采用倍比稀釋?？稍?EP管中稀釋。第一管為最高待測濃度的藥液。自第二管分別加入一定量的維持培養(yǎng)基，然后從第一管吸取等量的藥液至第二管，吹打混勻后,棄去tip頭并換新tip頭，從第二管吸取等量藥液至第三管，吹打混勻。依此操作直至倒數(shù)第二管。最后一管為維持培養(yǎng)基，不含藥物。藥物處理：棄去細(xì)胞培養(yǎng)液，注意吸除干凈。然后吸取已稀釋的藥液180出睢IJ對應(yīng)的細(xì)胞孔中。各濃度組均設(shè)三孔重復(fù)，最后一排孔為細(xì)胞對照。另設(shè)培養(yǎng)基對照。如圖1。加藥后在5%CO2, 37c細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)72 h;按上述步驟換新鮮含藥培養(yǎng)基，共2次。最后一次換藥后再培養(yǎng) 72 h,準(zhǔn)備檢測。00000000 00000000 。 ooeoeeeo 。 。 。 oeeeeeeo ooooooeo 00000000圖1黃色部分為PBS,無細(xì)胞；綠色為培養(yǎng)基對照；粉色、藍(lán)色部分為兩種不同的藥物處理，每種藥物設(shè)三個(gè)重復(fù)，8個(gè)濃度，紅色部分為細(xì)胞空白對照。MTT檢測：將MTT母液（5mg/ml , 10X）用PBS稀釋為1 X）。去除各孔中的培養(yǎng)液（注 意：盡可能去除干凈！），加入 1XMTT, 2