突觸內(nèi)NMDAR通道電流在培養(yǎng)神經(jīng)元發(fā)育中的變化

1、突觸內(nèi)NMDAR通道電流在培養(yǎng)神經(jīng)元發(fā)育中的變化 田映紅，胡德輝，李樹基，陳明，高天明【摘要】【目的】觀察培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)元突觸內(nèi)NDA受體NDAR通道電流在發(fā)育中的變化?！痉椒ā咳⌒律?dSD大鼠海馬制成細胞懸液，接種在培養(yǎng)板上進展培養(yǎng)。培養(yǎng)到1周和2周時，采用膜片鉗全細胞形式記錄神經(jīng)元突觸內(nèi)自發(fā)的微小興奮性突觸后電流EPS?！窘Y(jié)果】培養(yǎng)2周海馬神經(jīng)元突觸內(nèi)NDA受體介導的EPSEPSNDA幅度比培養(yǎng)1周神經(jīng)元小，對NR2B的特異拮抗劑ifenprdil的敏感性降低。Ifenprdil對培養(yǎng)1周神經(jīng)元EPSNDA的抑制作用到達80.476.12，卻只抑制12.272.02培養(yǎng)2周神經(jīng)元的EP

2、SNDA?！窘Y(jié)論】培養(yǎng)海馬神經(jīng)元突觸內(nèi)NDA受體通道電流有發(fā)育變化，提示培養(yǎng)1周神經(jīng)元突觸內(nèi)NDA受體NR2亞單位主要為NR2B；而神經(jīng)元培養(yǎng)到2周時，突觸內(nèi)NR2B亞單位逐漸被NR2A取代?！娟P(guān)鍵詞】海馬神經(jīng)元；N-甲基-D-天冬氨酸受體；膜片鉗記錄；突觸；EPS甲基-D-天冬氨酸受體N-ethyl-D-aspartiaidreeptr，NDAR是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中谷氨酸受體的一種類型，主要由2個NR1和2個NR2亞單位組成。NR2分為4種亞型，分別是NR2A，NR2B，NR2和NR2D，海馬和皮層神經(jīng)元主要是NR2A和NR2B。近年來的研究提示突觸內(nèi)和突觸外NDAR在突觸可塑性、細胞內(nèi)信號級聯(lián)

3、及興奮毒方面的作用不同1-3，因此明確突觸內(nèi)、外NDAR的亞單位組成對研究突觸內(nèi)、外NDAR參與不同功能具有重要作用。以前的研究發(fā)現(xiàn)突觸內(nèi)、外NDAR存在發(fā)育變化，但對突觸內(nèi)NDAR在發(fā)育中變化的研究根本都采用全細胞形式記錄誘發(fā)的興奮性突觸后電流evked-exitatrypst-synaptiurrent,eEPS4，5。這種方法往往會激活一部分突觸外NDAR，并且不是真正意義上的生理活動，因此本文采用膜片鉗全細胞形式記錄培養(yǎng)1周和2周海馬神經(jīng)元突觸內(nèi)NDAR介導的自發(fā)的EPS，同時利用NR2B的特異拮抗劑ifenprdil來觀察培養(yǎng)海馬神經(jīng)元突觸內(nèi)NDAR通道電流在發(fā)育中的變化，為討論不同

4、亞型NDAR參與不同作用提供理論基矗1材料與方法1.1實驗動物及試劑新生1dSD大鼠。試劑：DE/F12、neurbasal培養(yǎng)基(Gibi)；胎牛血清杭州四季青公司；乙二醇雙(2-氨基乙基)四乙酸EGTA，上海生工；多聚賴氨酸、阿糖胞苷、胰蛋白酶、N-2-羥乙基哌嗪-N-2-乙磺酸HEPES、甘氨酸、荷包牡丹堿biuullineethidide、士的寧stryhine、河豚毒TTX、ifenprdil、6-氰基-7-硝基喹喔啉-2,3-二酮(NQX)、2-氨基-5-磷酸基戊酸(d-APV)、鉀鹽K2ATP均為Siga產(chǎn)品；余為國產(chǎn)分析純。1.2方法在整個實驗過程中監(jiān)測輸入電阻和串聯(lián)電阻。輸入

5、電阻為500800，串聯(lián)電阻為2030。假設實驗中輸入電阻或串聯(lián)電阻變化超過20%，那么棄去該細胞。每個神經(jīng)元記錄到的事件數(shù)要大于30，用軟件inianalysis6.0進展分析。分析時幅度小于三倍基線噪聲的事件被排除。2結(jié)果2.1EPS幅度隨發(fā)育的變化EPS包括一快速衰減的成分和后面跟著的一緩慢衰減的成分圖1B中實線?？焖偎p的成分由a氨-甲基-異惡唑-丙酸受體APAR介導EPSAPA，可被5l/LNQXAPAR特異阻斷劑快速阻斷；緩慢衰減的成分由NDAR介導EPSNDA，可被100l/Ld-APV完全抑制圖1B中點線。由于EPSNDA的幅度小，很難從背景噪聲別離出來，因此我們將d-APV作

6、用前后的電流相減，即可間接得到EPSNDA圖1B中點線。統(tǒng)計結(jié)果顯示培養(yǎng)2周的神經(jīng)元EPSNDA的平均幅度比培養(yǎng)1周小t=-3.645,P=0.004，但EPSAPA的幅度相應增大t=3.162,P=0.009，而總EPS的幅度無差異圖1、D，t=0.281,P=0.780。這些結(jié)果說明突觸內(nèi)EPS的幅度存在發(fā)育變化。2.2NR2B特異拮抗劑ifenprdil對突觸內(nèi)EPSNDA的影響10l/LNR2B特異拮抗劑ifenprdil使培養(yǎng)1周的海馬神經(jīng)元EPSNDA幅度平均減小(80.476.12)n6，僅阻斷了(12.272.02)培養(yǎng)2周神經(jīng)元的EPSNDAn7，二者差異有統(tǒng)計學意義t=-2

7、.360,P=0.030。3討論3.1突觸內(nèi)NDAR的發(fā)育變化我們發(fā)現(xiàn)10l/Lifenprdil阻斷了(80.476.12)培養(yǎng)1周海馬神經(jīng)元的EPSNDA，與阻斷重組NR1/NR2B的效果一致。Ifenprdil對NR1/NR2B的特異性高，對重組的NR1/NR2B的阻斷效應比重組的NR1/NR2A高400倍，因此ifenprdil可作為檢測NR1/NR2B是否存在及占多大比例的藥物6。但即便如此，ifenprdil也只能阻斷80左右的NR1/NR2B的反響。由于海馬和皮層神經(jīng)元NR2主要是NR2A和NR2B2-4，因此我們的結(jié)果提示培養(yǎng)1周神經(jīng)元突觸內(nèi)的NDAR主要為NR1/NR2B。1

8、0l/Lifenprdil只阻斷了培養(yǎng)2周神經(jīng)元EPSNDA的12.272.02，提示此時突觸內(nèi)NDAR主要為NR1/NR2A。我們的結(jié)果與NR2亞單位的表達存在發(fā)育變化一致。胚胎晚期及出生后海馬主要表達NR2B，NR2D有少量表達。出生1周后才出現(xiàn)NR2A的表達。但出生2周后，NR2A的表達超過NR2B的表達，占主要地位。以前的研究結(jié)果提示在突觸內(nèi)同一受體復合物存在異源的NR1/NR2A/NR2B4,7。由于NR1/NR2A/NR2B對ifenprdil的敏感性也很低4,6，因此我們推測培養(yǎng)2周的海馬神經(jīng)元突觸內(nèi)可能存在NR1/NR2A異二聚體和NR1/NR2A/NR2B異三聚體。我們的結(jié)果

9、與以前的報道略有差異。Tvar4和Thas5等認為培養(yǎng)2周的海馬神經(jīng)元突觸內(nèi)也主要為NR1/NR2A，但他們發(fā)現(xiàn)ifenprdil仍可阻斷40左右的NDAR介導的EPS，因此推測突觸內(nèi)仍存在一部分NR1/NR2B。存在差異的原因可能是采用的標本和記錄的方式不同。他們采用低密度法培養(yǎng)細胞，記錄的是自身突觸。這種模型雖然可用來記錄突觸內(nèi)和突觸外電流，但在生物體中畢竟不可能只存在自身突觸。此外，他們記錄的是誘發(fā)的EPS，這種方法在激活突觸內(nèi)NDAR的同時也可能激活一部分突觸外NDAR，而突觸外NDAR主要為NR1/NR2B，因此誘發(fā)的EPSNDA對ifenprdil的敏感性較高。而我們記錄自發(fā)的EP

10、S，完全是由突觸內(nèi)受體介導的，并且更表達生理狀態(tài)的突觸活動。3.2突觸內(nèi)NDAR發(fā)育變化的可能機制以前人們發(fā)現(xiàn)突觸的形成首先需要NR2B，是一種非活動依賴性的方式。隨著活動發(fā)生，當配體與突觸處的NR1/NR2B結(jié)合，這些受體會發(fā)生內(nèi)吞，被NR1/NR2A取代。NDAR位于興奮性突觸的突觸后膜，由NR2亞單位-末端PDZ結(jié)合區(qū)與突觸后膜一些腳手架蛋白如PSD-95家族結(jié)合形成突觸后致密斑pstsynaptidensity,PSD8。-末端作為調(diào)節(jié)蛋白或附屬蛋白的靶區(qū)，在促進受體組裝、分類或靶向中起作用，并參與不同通道的形成及功能調(diào)節(jié)，是NDAR定位在突觸處的關(guān)鍵。NR2A和NR2B的胞內(nèi)-末端區(qū)

11、域不同，分別是627和644個氨基酸，因此它們與不同的PSD蛋白有不同的親和力，NR2A更易與PSD-95結(jié)合，而NR2B更易與SAP-102結(jié)合。PSD-95與NR2A結(jié)合后能增加NR2A在突觸處的表達并減少突觸內(nèi)NR2B的表達9。發(fā)育過程中最初的突觸活動可導致NR2A與PSD-95的結(jié)合迅速增加10，并且PSD-95的表達也隨發(fā)育增加11，因此可促進突觸處NR2A的增加及NR2B的減少。此外NR2A和NR2B的末端有不同內(nèi)吞模塊，這些內(nèi)吞模塊與籠形蛋白適配器有不同親和力12。成年突觸處NR2B的內(nèi)吞多于NR2A，因此NR2A在突觸的表達更穩(wěn)定。由于突觸內(nèi)和突觸外NDAR之間會發(fā)生側(cè)移13，我們推測發(fā)育后期突觸內(nèi)NR2B被NR2A取代還可能是NR2B側(cè)向挪動到突觸外的結(jié)果。我們確實發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)2