航天誘變鳳仙花種子抗菌肽的分離純化及抗菌活性研究初報

1、航天誘變鳳仙花種子抗菌肽的別離純化及抗菌活性研究初報【關鍵詞】航天誘變;鳳仙花;抗菌肽;別離純化抗菌肽(AntiirbialPeptides，APs)，是生物界中廣泛存在的一類生物活性小肽，具有抗細菌或真菌作用，有些還具有抗原蟲、病毒或腫瘤細胞的功能1?？咕木哂袕V譜的抗菌作用，對革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、真菌具有抑制作用；可以殺傷動物體內的腫瘤細胞，卻又不破壞動物體內的正常細胞2，3。因此，抗菌活性肽的開發(fā)與應用研究已成為國內外昆蟲學、植物學、生理學、藥理學研究的熱點。鳳仙花是一種較早開發(fā)的藥用植物。中醫(yī)認為,鳳仙花子能通經活血、軟堅散結；根葉有散血通絡、祛風止痛、解毒療瘡之成效。近年來，

2、研究發(fā)現(xiàn)鳳仙花還有抑菌、消炎和抗癌等作用。本試驗采用的材料是普通鳳仙花種子搭載“神舟四號航天飛船繞太空運行6天18小時后播種，由鳳仙花航天突變植株獲得的第四代種子(SP4)。研究47證實航天誘變鳳仙花種子，由于宇宙射線、交變磁嘗微重力和高真空等因素的影響，其染色體出現(xiàn)了大規(guī)模不規(guī)那么變異，可能導致基因突變，從而影響植物體內蛋白質的合成。因此，航天誘變鳳仙花抗菌肽的別離、純化具有重要的研究價值，對航天誘變育種、抗菌肽的大量消費以及抗菌藥物的開發(fā)等具有實際意義，在國內外尚屬首次。1材料航天誘變鳳仙花種子(SP4)由西華師范大學生命科學學院湯澤生教授提供。供試菌株：枯草芽孢桿菌(Baillussub

3、tilis)和大腸桿菌(Esherihiali)由實驗室保存；金黃色葡萄球菌(Staphylusaureus)購自于中國科學院微生物研究所菌種保存中心，綠膿桿菌(P.aeruginsa)由四川省綿陽市第三人民醫(yī)院呼吸科提供。2方法2.1粗提物的搜集及抑菌作用稱取適量航天誘變鳳仙花干種子，磨成粉末，采用磷酸緩沖液于4冰箱浸提24h后離心取上清液。沉淀反復浸提數(shù)次，合并上清液，于4采用硫酸銨80%飽和度鹽析搜集沉淀的蛋白質，并透析脫鹽，獲得種子總蛋白質。將種子總蛋白溶液用枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和綠膿桿菌做抑菌實驗。2.2抗菌肽的初步純化采用illipre小型切向流超濾系統(tǒng)對脫鹽后的

4、蛋白質進展初步別離，選用使用截留量為50KD，10KD和5KD的膜包經過3次分級別離，獲得了抗菌肽粗提物。將上述各提取物上樣18柱，以99.9%乙腈和0.1%三氟乙酸TFA為洗脫液，以3.0lin-1的流速進展洗脫，紫外檢測儀器檢測其D210處的吸光值。搜集具有抑菌活性的樣品冷凍真空枯燥至粉末，20保存。同時參考孫雪文等8的方法，采用改良的Triine-SDS電泳系統(tǒng)檢測每步產品的分子量并進展抑菌試驗。2.3抗菌肽的純化用0.2的一次性濾頭對超濾別離出來的分子量小于5KD的小分子蛋白質樣品進展過濾，除去不溶性雜質。再采用安捷倫18制備柱進展抗菌肽的純化，流動相99.9%乙腈與0.1%三氟乙酸T

5、FA，流速3.0lin-1，柱溫23。用紫外檢測器在波長為210n下測紫外吸收值。搜集各峰，冷凍真空枯燥至粉末。將凍干品稀釋后做抑菌試驗，有抑菌活性的峰就含有抗菌肽。2.4抗菌肽抑菌活性的測定采用紙片法來進展抑菌活性檢測。細菌培養(yǎng)基為LB固體培養(yǎng)基。菌種為枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和綠膿桿菌。在直徑為10的平皿內傾倒培養(yǎng)基；待平板冷卻，汲取調整好濃度的，處于對數(shù)生長期的供試菌懸液100l于平板上，用無菌涂布器均勻涂布于平板外表。每種供試菌涂布兩個平板，每個平板貼4張直徑為6的無菌紙片，其中兩片加滴加20l抗菌肽樣品，另外兩片滴加無菌水作對照。在37培養(yǎng)24h(綠膿桿菌和枯草芽孢桿菌

6、的培養(yǎng)溫度為24)，測量各抑菌圈直徑，以表示抗菌活性。2.5抗菌肽的電泳檢測以分子量73，50，35，25，16，8，2kDa蛋白質為標準蛋白。因此本課題組參考孫雪文等8的方法，采用改良的Triine-SDS電泳系統(tǒng)，對提取的小分子多肽的分子量進展檢測。轉貼于論文聯(lián)盟.ll.3結果3.1蛋白質粗提結果由圖1可以看出，蛋白質粗提物中含有多種蛋白質，其中在29KD附近存在有染色較深的條帶，說明粗提物中含有小分子蛋白質，且含量較高。圖1中條帶25是第1次超濾，用50KD的膜包截留得到的分子量小于50KD的蛋白質。3.2抗菌肽超濾初步純化結果經過超濾對種子總蛋白質進展初步別離，得到的分子量小于5KD的

7、小分子蛋白質樣品進展電泳檢測，分別用考馬斯亮藍和硝酸銀染色法對凝膠進展染色，在2KD左右都可以清楚的看到一條明晰的小分子蛋白質條帶，在圖上還出現(xiàn)了8KD以上的蛋白質條帶，這是由于5KD超濾膜在截留的過程中，在壓力的作用下，5KD的膜包可以通過3倍分子量以上的蛋白質。3.3抗菌肽純化結果對超濾得到的小分子蛋白質采用高效液相再進展別離純化。首先采用18制備柱來別離分子量小于5KD的蛋白質，根據(jù)峰的情況，分段搜集別離出來的物質，凍干，溶于無菌蒸餾水中。經過Triine-SDS電泳和抑菌活性鑒定后發(fā)現(xiàn)，搜集的a-b段在2KD左右有條帶，也具有抑菌活性。由于超濾別離出來的小分子蛋白質雜質太多，需要進一步

8、純化a-b段物質。按照高效液相第1次制備的方法對搜集的a-b段進展再純化，結果見圖2，可知第2次別離制備的蛋白質相對較純，雜質含量少。搜集主峰，然后進展電泳及抑菌活性檢測，檢測發(fā)現(xiàn)主峰分子量在2KD左右，且具有抑菌活性。3.4電泳檢測結果對高效液相制備過程中，各步驟產品凍干粉溶解，進展電泳鑒定其分子量。結果見圖2。電泳檢測說明此從航天誘變鳳仙花種子中提取的物質分子量在2KD左右，帶型明晰，緊湊，結果非常理想。3.5抑菌活性檢測結果與分析抑菌實驗結果見表1。結果說明，從航天誘變鳳仙花種子中提取出的低分子量蛋白質對金黃色葡萄桿菌、綠膿桿菌有明顯的抑菌作用，且抑菌作用持續(xù)時間較長；分別觀察48h和7

9、2h后，抑菌圈沒有被感染。對大腸桿菌抑菌效果不太明顯，抑菌圈較小，對枯草芽孢桿菌幾乎沒有抑菌作用。表1抗菌肽抑菌實驗結果略4討論本實驗選用動物源性金黃色葡萄球菌(Staphylusaureus)、大腸桿菌(Esherihiali)、綠膿桿菌(P.aeruginsa)和植物源性枯草芽孢桿菌(Baillussubtilis)4種菌株來做抑菌試驗，發(fā)現(xiàn)提取的低分子量蛋白質對金黃色葡萄球菌和綠膿桿菌有明顯的抑菌作用，但對大腸桿菌的抑菌作用比擬弱，對枯草芽孢桿菌的抑菌作用不明顯。在接種的過程中發(fā)現(xiàn)，隨著低分子量蛋白質溶液量的增加，抑菌圈從無到有，從小到大，因此證明種子中確實存在具有抗菌作用的分子量大約2

10、KD左右的小肽，即抗菌肽。但是其抗菌機制和抗菌譜還需要進一步研究建立。通過對航天誘變鳳仙花種子總蛋白質的粗提、別離和純化，經電泳獲得了分子量在2KD左右的具有抗菌活性的小分子蛋白質，推測航天誘變的鳳仙花種子中存在抗菌肽。1997年，Tailr等首次從鳳仙花種子中別離出4種對真菌和細菌表現(xiàn)出寬范圍的抑制作用，而對培養(yǎng)的人細胞沒有毒性的肽-Ib-AP1、Ib-AP2、Ib-AP3、Ib-AP4，而本實驗室別離純化出來只有一種小肽。一方面說明，航天誘變鳳仙花種子中抗菌肽的基因可能已經發(fā)生了改變，另一方面也可能由于這4種基因編碼的小肽分子量接近，在電泳時不易分開，要想徹底弄清該基因是否發(fā)生了突變還有待

11、于進一步深化研究。本實驗說明，從航天誘變鳳仙花種子中直接別離純化小分子抗菌肽，由于材料比擬少、別離純化過程繁瑣、本錢高、不易檢測以及容易失去活性等。因此，要獲得大量抗菌肽進而研究其抗菌機制、理化性質、分子構造等，還需要采用基因工程技術構建DNA文庫和抗菌肽基因工程菌，為挑選抗菌肽基因和大量消費抗菌肽奠定基矗目前，鳳仙花抗菌肽對綠膿桿菌的抑菌活性并未見報道。綠膿桿菌是是傷口感染較常見的一種細菌，能引起化膿性病變其致病力較低但抗藥性強。通過本實驗發(fā)現(xiàn)，航天誘變鳳仙花種子中純化出的小肽對綠膿桿菌具有較強的抑制作用，為以后開發(fā)肽類抗生素、特別是針對耐藥性細菌的藥物具有重大意義。同時也說明，在誘變的鳳仙

12、花種子中，抗菌肽的基因可能發(fā)生了突變，這種突變有可能增強了抗菌肽的活性，對以后研究誘變育種具有重要的應用價值?！緟⒖嘉墨I】1胡云龍,趙學忠,屈賢明.抗菌肽的分子生物學研究進展J.生物工程進展,1997,17(3):14.2李恩民,劉維全,殷震.抗菌肽的特性及其應用前景J.中國藥理學通報,1998,14(3):209.3arshallSH,ArenasG.Antiirbialpeptides:AnaturalalternativetheialantibitisandaptentialfrappliedbitehnlgyJ.EletrniJurnalfBitehnlgy,2022,6(2):1542.4湯澤生,楊軍,趙燕,等.航天誘變鳳仙花SP1代花、果實和種子的研究J.西華師范大學學報(自然科學版),2022,26(1):47.5李海濤,湯澤生,彭正松,等.航天誘變鳳仙花SP1代多分孢子現(xiàn)象的回歸分析J.西北農林科技大學學報