基因工程載體

1、基因工程載體第1頁，共244頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)23分，星期二第四章 基因工程載體vectors第2頁，共244頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)23分，星期二在基因工程操作中，把能攜帶外源DNA進(jìn)入受體細(xì)胞的DNA分子叫載體。一、載體 （Vectors）廣義上通常把能攜帶外源基因進(jìn)入受體細(xì)胞的運(yùn)載工具叫載體。第3頁，共244頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)23分，星期二（1）具有對受體細(xì)胞的可轉(zhuǎn)移性，可提高載體導(dǎo)入受體細(xì)胞的效率。（2）具有與特定受體細(xì)胞相適應(yīng)的復(fù)制原點(diǎn)或整合位點(diǎn)，使得外源基因可在受體細(xì)胞中大量繁殖或穩(wěn)定遺傳。（3）具有多種單一的核酸酶切位點(diǎn)(多克隆位點(diǎn))，可

2、用于外源基因的插入，同時(shí)不影響載體的擴(kuò)增和繁殖。（4）具有合適的選擇標(biāo)記，便于重組DNA分子的檢測。（5）具有較好的安全性，不能任意轉(zhuǎn)移，避免基因的非控制性擴(kuò)散，給人類造成危害2. 基因工程對載體的要求第4頁，共244頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)23分，星期二第5頁，共244頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)23分，星期二第6頁，共244頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)23分，星期二3. 載體 的種類 基因工程中常用的載體有5類： 質(zhì)粒（plasmid） 單鏈DNA噬菌體M13 噬菌體的衍生物 柯斯質(zhì)粒（cosmid） 動(dòng)物病毒（virus） 來源第7頁，共244頁，2022年，5月2

3、0日，22點(diǎn)23分，星期二功能克隆載體: 克隆一個(gè)基因或DNA片段表達(dá)載體: 用于一個(gè)基因的蛋白表達(dá)整合載體: 把一個(gè)基因插入到染色體組中第8頁，共244頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)23分，星期二第一節(jié) 質(zhì)粒載體 一、質(zhì)粒（plasmid） 是獨(dú)立于染色體以外的能自主復(fù)制的雙鏈閉合環(huán)狀DNA分子。存在于細(xì)菌、霉菌、藍(lán)藻、酵母等細(xì)胞中。第9頁，共244頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)23分，星期二大腸桿菌的質(zhì)粒第10頁，共244頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)23分，星期二（1）分子小： 1. 質(zhì)粒的一般生物學(xué)特性1500 kb（2）編碼基因少： 23個(gè)中等大小的蛋白質(zhì)。 （3）環(huán)形狀

4、：雙鏈環(huán)狀DNA。（酵母的“殺傷質(zhì)?！笔荝NA,編碼毒性糖蛋白）。如抗菌素抗性、代謝特征等，賦予細(xì)菌一些額外的特性（非必須）。第11頁，共244頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)23分，星期二（4）質(zhì)粒的空間構(gòu)型： 共價(jià)閉合環(huán)狀DNA（cccDNA)呈超螺旋（SC）（super coil）Covalent close circular DNA第12頁，共244頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)23分，星期二 線形DNA （ linear ，lDNA）一條鏈上有一至數(shù)個(gè)缺口。 開環(huán)DNA（ open circular， ocDNA）第13頁，共244頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)23分，星期

5、二（5）質(zhì)?？臻g構(gòu)型與電泳速率同一質(zhì)粒盡管分子量相同，不同的構(gòu)型電泳遷移率不同：scDNA最快、l DNA次之、ocDNA最慢。SCOCL第14頁，共244頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)23分，星期二（6）氯化銫密度梯度離心提取質(zhì)粒超螺旋質(zhì)粒開環(huán)和線性質(zhì)粒染色體DNA加入EB加入EB結(jié)合EB少結(jié)合EB多緊密密度高松散密度低密度梯度離心分離原理第15頁，共244頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)23分，星期二氯化銫密度梯度離心法步驟： 用含有EDTA的緩沖液懸浮菌體 加溶菌酶裂解細(xì)菌細(xì)胞壁 加CsCl和溴乙錠超速離心過夜在紫外燈下注射器吸取cccDNA稀釋沉淀cccDNAproteinsoc

6、DNAL-DNAcccDNARNAs過Dowex AG50W-X8柱子，用數(shù)倍體積的TE/0.2mol/L NaCL清洗去除EB第16頁，共244頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)23分，星期二二、質(zhì)粒的類型在大腸桿菌中的質(zhì)粒，可以分為： 接合型質(zhì)粒:非接合型質(zhì)粒能自我轉(zhuǎn)移不能自我轉(zhuǎn)移1、依據(jù)質(zhì)粒自身傳遞的性質(zhì)分類第17頁，共244頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)23分，星期二除了帶有自我復(fù)制所必需的遺傳信息外還帶有一套控制細(xì)菌配對和質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移的基因。如：F質(zhì)粒（性質(zhì)粒、或F因子）：甚至能使寄主染色體上的基因隨其一道轉(zhuǎn)移到原先不存在該質(zhì)粒的受體菌中。又叫自我轉(zhuǎn)移型質(zhì)粒。1. 接合型質(zhì)粒：不

7、符合基因工程的安全要求。第18頁，共244頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)23分，星期二大腸桿菌接合（conjunction）第19頁，共244頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)23分，星期二2. 非接合型質(zhì)粒：雖然帶有自我復(fù)制所必需的遺傳信息，但失去了控制細(xì)菌配對和質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移的基因，因此不能從一個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到另一個(gè)細(xì)胞。（1）R質(zhì)粒（抗性質(zhì)粒）：帶有一種或數(shù)種抗生素抗性基因，使寄主獲得同樣的抗生素抗性性狀（resistance）。符合基因工程的安全要求。第20頁，共244頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)23分，星期二磺胺氨芐青霉素卡那霉素四環(huán)素鏈環(huán)素汞鹽抗性第21頁，共244頁，2022

8、年，5月20日，22點(diǎn)23分，星期二帶有控制大腸桿菌素（colicin）合成的基因。（2）Col質(zhì)粒：大腸桿菌素對不帶Col質(zhì)粒的大腸桿菌有毒。Col質(zhì)?；騌質(zhì)粒如果帶有轉(zhuǎn)移基因，也可以成為接合型質(zhì)粒。第22頁，共244頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)23分，星期二2、依據(jù)可否引起宿主細(xì)胞出現(xiàn)新性狀分類顯性質(zhì)粒:宿主細(xì)胞由于含有質(zhì)粒而獲得新性狀隱蔽質(zhì)粒:宿主細(xì)胞含有此類質(zhì)粒而無異樣性狀隱蔽是因?yàn)槭軝z測的手段的限制，而不能觀測到新性狀第23頁，共244頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)23分，星期二A. 嚴(yán)緊型質(zhì)粒（stringent plasmid）拷貝數(shù)少，只有13份拷貝。B. 松弛型質(zhì)粒

9、（relaxed plasmid）拷貝數(shù)多，有1060份拷貝。（接合型質(zhì)粒分子量大，一般屬嚴(yán)緊型）。（非接合型質(zhì)粒分子量小，一般屬松弛型）。3、依據(jù)質(zhì)粒的復(fù)制特性分類第24頁，共244頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)23分，星期二三、質(zhì)粒的不親和性親緣關(guān)系密切的質(zhì)粒一般屬于不親和性質(zhì)粒，如野生型質(zhì)粒與其衍生的重組質(zhì)粒往往屬于不親和性質(zhì)粒。 （攘外必先安內(nèi)） 不同質(zhì)粒有的可共存于同一細(xì)胞之中，但有的不行。把能同寓于一細(xì)胞中的不同質(zhì)粒稱為親和性質(zhì)粒。相反不能同寓于一細(xì)胞中的不同質(zhì)粒稱為不親和性質(zhì)粒或不相容性質(zhì)粒。第25頁，共244頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)23分，星期二（1）分子量大，拷

10、貝數(shù)低四、質(zhì)粒載體的構(gòu)建1. 天然質(zhì)粒的局限性第一個(gè)用于基因克隆的天然質(zhì)粒pSC101，分子長 9.1 kb。但只有一個(gè)EcoR I切點(diǎn)充當(dāng)克隆位點(diǎn)，Tetr 作為篩選標(biāo)志。第26頁，共244頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)23分，星期二第27頁，共244頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)23分，星期二ColE1質(zhì)粒的篩選標(biāo)志是大腸桿菌素E1（colicin E1）。（2）篩選標(biāo)志不理想可以通過插入失活篩選。但細(xì)菌群體容易自發(fā)突變出抗colicin E1的細(xì)胞.colicin E1能殺死不含ColE1 質(zhì)粒的菌，形成“噬菌斑”。唯一的克隆位點(diǎn) EcoR I 正好位于這個(gè)基因的內(nèi)部。第28頁，

11、共244頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)23分，星期二ColE1第29頁，共244頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)23分，星期二（1）具有復(fù)制起點(diǎn)（ORI）2. 質(zhì)粒載體必須具備的基本條件（2）具有抗菌素抗性基因（3）若干限制性內(nèi)切酶的單一位點(diǎn)：是篩選的標(biāo)志。理想的載體應(yīng)該有兩種抗菌素抗性基因。用來插入外源DNA片段。且插入后不影響復(fù)制功能。第30頁，共244頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)23分，星期二（4）具有較小的分子量和較高的拷貝數(shù)。第31頁，共244頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)23分，星期二3. 構(gòu)建質(zhì)?？寺≥d體的基本原則A、選用合適的出發(fā)質(zhì)粒。出發(fā)質(zhì)粒（也稱為親本質(zhì)粒）

12、中應(yīng)含有克隆載體必備的元件，如復(fù)制起始原點(diǎn)、用于選擇標(biāo)記的基因、克隆位點(diǎn) B、獲得構(gòu)建質(zhì)?？寺≥d體的元件。 C、組裝合適的選擇標(biāo)記基因。 D、構(gòu)建過程中，應(yīng)盡可能的刪除載體上不必要的DNA序列，以縮小質(zhì)粒的分子量，提高外源DNA的裝載量。 E、構(gòu)建過程中，需要滅活出發(fā)質(zhì)粒上的某些編碼基因 第32頁，共244頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)23分，星期二氨芐青霉素抗性（Ampr） 卡那霉素抗性 （Kanr） 四環(huán)素抗性 （Tetr） 鏈霉素抗性 （Strr） 氯霉素抗性 （Cmlr）4. 質(zhì)粒的選擇標(biāo)記及其工作原理：（1）選擇標(biāo)記 抗菌素抗性絕大多數(shù)質(zhì)粒載體都是用抗菌素抗性標(biāo)記：第33頁，共2

13、44頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)23分，星期二 常用抗菌素的抗性工作原理i）氨芐青霉素（Ampicillin，Amp）青霉素的衍生物。通過干擾細(xì)菌細(xì)胞壁合成的末端反應(yīng)，殺死生長的細(xì)菌。a）抑菌原理b）細(xì)菌抗性原理Ampr基因編碼-內(nèi)酰胺酶，特異地切割氨芐青霉素的-內(nèi)酰胺環(huán)。 第34頁，共244頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)23分，星期二ii）氯霉素（chloramphenicol，Cml）通過與50S核糖體亞基結(jié)合，干擾細(xì)胞蛋白質(zhì)的合成并阻止肽鍵的形成。殺死生長的細(xì)菌。b）細(xì)菌抗性原理Cmlr 編碼乙酰轉(zhuǎn)移酶，特異地使氯霉素乙?；Щ?。a）抑菌原理第35頁，共244頁，2022年，

14、5月20日，22點(diǎn)23分，星期二a）殺菌原理iii）卡那霉素（kanamycin，Kan）通過與70S核糖體結(jié)合，導(dǎo)致mRNA發(fā)生錯(cuò)讀。殺死細(xì)菌。b）細(xì)菌抗性原理Kanr 編碼的氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶，對卡那霉素進(jìn)行修飾，阻斷其與核糖體結(jié)合作用。第36頁，共244頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)23分，星期二iv）鏈霉素（Streptomycin，Str）a）殺菌原理通過與30S核糖體亞基結(jié)合，導(dǎo)致mRNA錯(cuò)譯。殺死細(xì)菌。b）細(xì)菌抗性原理Strr 編碼一種氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶對鏈霉素進(jìn)行修飾，阻斷其與核糖體30S亞基結(jié)合作用。第37頁，共244頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)23分，星期二v）四

15、環(huán)素（Tetracycline，Tet）b）細(xì)菌抗性原理a）抑菌原理通過于30S核糖體亞基結(jié)合，干擾細(xì)胞蛋白質(zhì)的合成并阻止肽鍵的形成。殺死生長的細(xì)菌。Tetr 編碼特異性蛋白質(zhì)，對細(xì)菌的膜結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾，組止四環(huán)素通過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)。第38頁，共244頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)23分，星期二第39頁，共244頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)23分，星期二第40頁，共244頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)23分，星期二 遺傳標(biāo)記使受體菌發(fā)生遺傳性狀的改變的基因。營養(yǎng)標(biāo)記其他標(biāo)記：如藍(lán)白斑篩選第41頁，共244頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)23分，星期二當(dāng)帶有抗菌素抗性基因的載

16、體進(jìn)入受體菌后，受體菌才能生長。不帶有抗菌素抗性基因的受體菌不能在含有抗菌素的培養(yǎng)基（選擇培養(yǎng)基）中生長。（2）抗菌素選擇原理活死抗性基因抗菌素第42頁，共244頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)23分，星期二5. 人工構(gòu)建的質(zhì)粒載體的類型（1）高拷貝數(shù)的質(zhì)粒載體ColE1、pMB1派生質(zhì)粒具有高拷貝數(shù)的特點(diǎn)。而且在沒有菌體蛋白質(zhì)合成的條件下（蛋白質(zhì)合成抑制劑，氯霉素等存在下）仍能復(fù)制，達(dá)到每個(gè)細(xì)胞的拷貝數(shù)10003000個(gè)！適合大量增殖克隆基因、或需要表達(dá)大量的基因產(chǎn)物。第43頁，共244頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)23分，星期二（2）低拷貝數(shù)的質(zhì)粒載體 但有特殊用途:由pSC101派

17、生來的載體特點(diǎn)是分子量小，拷貝數(shù)低。當(dāng)有些被克隆的基因的表達(dá)產(chǎn)物過多時(shí)會(huì)嚴(yán)重地影響寄主菌的正常代謝活動(dòng)，導(dǎo)致寄主菌死亡時(shí)，就需要低拷貝的載體。pLG338、pLG339、pHSG415等不適合大量擴(kuò)增DNA用。第44頁，共244頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)23分，星期二（3）失控的質(zhì)粒載體這是一類溫度敏感型復(fù)制控制質(zhì)粒。溫度低（低于35 oC），拷貝數(shù)很少； 溫度增加（35 oC）時(shí)，拷貝數(shù)會(huì)很快增加到1000個(gè)以上。如pBEU1、pBEU2。runaway plasmid vectors1979年B. E. Uhlin等構(gòu)建。第45頁，共244頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)23分，

18、星期二（4） 插入失活型質(zhì)粒載體載體的克隆位點(diǎn)位于其某一個(gè)選擇性標(biāo)記基因內(nèi)部。如pDF41、pDF42、pBR329?？咕乜剐酝庠碊NA無抗菌素抗性第46頁，共244頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)23分，星期二（5）正選擇的質(zhì)粒載體如pUR2、pTR262等。只有帶有選擇標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)化菌細(xì)胞才能在選擇培養(yǎng)基上生長。直接選擇轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞。目前通用的絕大部分質(zhì)粒載體都是正選擇載體。Direct selection vectors第47頁，共244頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)23分，星期二SmaIBamHIEcoRIHpaIEcoRIHindKil基因Pkn80（17kb）PKN80質(zhì)粒

19、帶有來自Mu噬菌體DNA的EcoRI-C片段，它編碼一種kil基因，使Mu噬菌體非溶源菌株致死。 HindIII位點(diǎn)上插入外源DNA HindIII位點(diǎn)無插入外源DNA Kil基因無活性Kil基因有活性Mu噬菌體非溶源菌株致死Mu噬菌體非溶源菌株存活第48頁，共244頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)23分，星期二（6） 表達(dá)型質(zhì)粒載體主要用來使外源基因表達(dá)出蛋白質(zhì)產(chǎn)物。如果在大腸桿菌里表達(dá)，必須把所克隆的真核生物的基因置于大腸桿菌的轉(zhuǎn)錄翻譯信號(hào)控制之下。注意啟動(dòng)子的性質(zhì)，終止子、起始密碼、終止密碼的閱讀正確。第49頁，共244頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)23分，星期二復(fù)制起始點(diǎn)ORI、

20、 選擇標(biāo)記、 多克隆位點(diǎn)MCS2）大腸桿菌操縱子元件阻遏基因 I 操縱基因O 啟動(dòng)基因P 核糖體結(jié)合位點(diǎn)序列（SD） 轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)區(qū)。1）普通載體元件 表達(dá)載體的結(jié)構(gòu)第50頁，共244頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)23分，星期二利用質(zhì)粒載體將真核生物基因轉(zhuǎn)入大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá),該質(zhì)粒載體應(yīng)具備哪些元件?1）普通載體元件復(fù)制起始點(diǎn)ORI、 選擇標(biāo)記、 多克隆位點(diǎn)MCS2）大腸桿菌操縱子元件阻遏基因 I 操縱基因O 啟動(dòng)基因P 核糖體結(jié)合位點(diǎn)序列（SD） 轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)區(qū)。第51頁，共244頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)23分，星期二第52頁，共244頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)23分

21、，星期二五、經(jīng)典的大腸桿菌質(zhì)粒載體1. pSC101第一個(gè)成功地用于克隆實(shí)驗(yàn)的大腸桿菌質(zhì)粒載體。（1）類型天然質(zhì)粒，屬低拷貝型。（2）長度9.09 kb。（3）選擇標(biāo)記四環(huán)素抗性Tetr第53頁，共244頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)23分，星期二6個(gè)克隆位點(diǎn)： EcoR I、Xho I、Pvu I、Hind III、BamH I、Sal I 主要使用EcoR I。（其中Hind III、BamH I、Sal I 3個(gè)位于選擇標(biāo)記Tetr的內(nèi)部）（4）克隆位點(diǎn)第54頁，共244頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)23分，星期二第55頁，共244頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)23分，星期二

22、2. ColE1（1）類型天然質(zhì)粒，屬高拷貝型。（2）長度6.3 kb。（3）選擇標(biāo)記大腸桿菌素（colicin）E1和對E1免疫的基因（immE1）特點(diǎn)是在培養(yǎng)基中加入氯霉素抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)合成后，質(zhì)粒仍然能復(fù)制達(dá)到每個(gè)細(xì)胞1000-3000拷貝之多！第56頁，共244頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)23分，星期二 colicin E1基因的結(jié)構(gòu)ceaimmkil結(jié)構(gòu)基因免疫基因溶菌基因 殺死不含有ColE1細(xì)菌的原因cea + kil基因產(chǎn)物 不被其他細(xì)菌的colicin E1所殺死的原因imm基因第57頁，共244頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)23分，星期二EcoR I位于E1內(nèi)部，

23、插入外源DNA會(huì)導(dǎo)致E1失活，使受體菌不能合成E1（ColE1-），但仍然表現(xiàn)出對E1免疫型（ImmE1+）。EcoR I（4）克隆位點(diǎn)Colicin E1外源DNA無Colicin第58頁，共244頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)23分，星期二用對外源colicin E1的免疫性和自身不能合成colicin E1作選擇，操作非常繁雜。 對colicin E1敏感的細(xì)菌群體中自發(fā)突變產(chǎn)生抗colicin E1的頻率很高！（5）ColE1的選擇缺陷ColE1抗 colicinE1殺ColE1-仍抗 colicinE1不殺ColE1-插入片段ColE1第59頁，共244頁，2022年，5月20日

24、，22點(diǎn)23分，星期二第60頁，共244頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)23分，星期二pSP2124質(zhì)粒的Ampr基因3. pBR322：（1）元件來源F. Bolivar和R.L. Rodriguez人工構(gòu)建載體。 復(fù)制起點(diǎn) oripMB1系列（來源于ColE1）的高拷貝型復(fù)制起點(diǎn) Ampr基因 Tetr基因pSC101的Tetr 基因。第61頁，共244頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)23分，星期二（2）長度4363bp（3）選擇標(biāo)記氨芐青霉素和四環(huán)素抗性。（4）克隆位點(diǎn)其中9個(gè)會(huì)導(dǎo)致Tetr基因失活（如BamH I、Hind 、Sal I）； 3個(gè)會(huì)導(dǎo)致Ampr基因失活（Sca I、

25、PvuI、Pst I）。24個(gè)克隆位點(diǎn)。第62頁，共244頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)23分，星期二第63頁，共244頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)23分，星期二（5）pBR322的優(yōu)點(diǎn) 雙抗菌素抗性選擇標(biāo)記 插入失活，分兩次先后選擇：沒有獲得載體的寄主細(xì)胞 在Amp或Tet中都死亡。獲得載體的寄主細(xì)胞 在Amp或Tet其中之一中死亡。第64頁，共244頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)23分，星期二外源基因BamH IAmp中存活但在Tet中死亡外源基因Pst ITet中存活但在Amp中死亡第65頁，共244頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)23分，星期二氯霉素?cái)U(kuò)增之后，每個(gè)細(xì)胞可

26、達(dá)10003000copy 安全失去了轉(zhuǎn)移蛋白基因mob（mobilization）。不能通過接合轉(zhuǎn)移。 高拷貝數(shù) 分子小，克隆能力大載體越小越好。 10kb的DNA在純化過程中容易段裂。第66頁，共244頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)23分，星期二保留了轉(zhuǎn)移蛋白（mob）的作用位點(diǎn)。（6）pBR322的缺點(diǎn)能夠被ColK質(zhì)粒編碼的mob蛋白識(shí)別，如果再有F質(zhì)粒的參與，就有可能轉(zhuǎn)移！第67頁，共244頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)23分，星期二 刪除mob識(shí)別位點(diǎn)（如質(zhì)粒pBR327、pAT153等）。pAT153：從pBR322上切去HaeII片段，既除去了mob識(shí)別位點(diǎn)，又增加質(zhì)粒

27、的拷貝數(shù)。（7）PBR322的改進(jìn)第68頁，共244頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)23分，星期二pBR325：在pBR322位點(diǎn)上接入一段來自噬菌體PICm的HaeII酶切片段（帶有氯霉素抗性基因cmlr）。 cmlr上也帶一個(gè)EcoRI位點(diǎn)。使EcoRI 也成為插入失活型位點(diǎn)。 改造EcoR I 位點(diǎn)第69頁，共244頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)23分，星期二4. pUC系列University of California的J. Messing和J. Vieria于1978年，在pBR322的基礎(chǔ)上改造而成。屬正選擇載體。pUC7、pUC8、pUC9、pUC10、pUC11、pUC

28、18、pUC19第70頁，共244頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)23分，星期二 復(fù)制起點(diǎn)pBR322的 ori但其上失去了克隆位點(diǎn)。 Ampr 基因（1）元件來源 lacZ的啟動(dòng)子大腸桿菌 lacZ基因大腸桿菌lacZ的-肽鏈序列， 是LacZ 的氨基端片段。pBR322的Ampr基因第71頁，共244頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)23分，星期二（2）長度約2.7kb（3）克隆位點(diǎn)10個(gè)連續(xù)的單一限制酶切位點(diǎn)，位于lacZ基因的5端。第72頁，共244頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)23分，星期二第73頁，共244頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)23分，星期二Ampicillin

29、抗性和 lacZ的肽互補(bǔ)（藍(lán)白斑）相結(jié)合。（4）選擇標(biāo)記藍(lán)白斑選擇原理： Xgal（5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-D-galactoside）第74頁，共244頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)23分，星期二-半乳糖苷酶能把無色的化合物Xgal分解成半乳糖和一個(gè)深藍(lán)色的物質(zhì)5-溴-4-氯靛藍(lán)。Xgal半乳糖5-溴-4-氯靛藍(lán)-半乳糖苷酶 -半乳糖苷酶Xgal顯色反應(yīng)：第75頁，共244頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)23分，星期二 lacZ的肽互補(bǔ)1）-肽（ lacZ ）：-半乳糖苷酶N端的一段氨基酸片段（11-41氨基酸）。lacZ只有在4聚體的狀態(tài)下才有功能.C端

30、大部分N端的11-41aaC端大部分N端的11-41aaC端大部分N端的11-41aaC端大部分N端的11-41aa4聚體第76頁，共244頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)23分，星期二2）受體菌lacZ突變受體菌基因組的-半乳糖苷酶基因的氨基端有缺失（缺失肽），不能形成4聚體的活性酶，不能分解Xgal 。受體菌株：JM系列、TG1、TG2、XL1-blue、XS127、XS101、KK2186、MV1184、DH5a。第77頁，共244頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)23分，星期二pUC質(zhì)粒載體上的lacZ 編碼肽與這個(gè)缺失突變的-半乳糖苷酶“互補(bǔ)”，使它能形成4聚體。又能分解Xgal。

31、產(chǎn)生藍(lán)色物質(zhì)。C端大部分N端的11-41aapUC lacZ 受體菌lacZ3）載體lacZ與互補(bǔ)第78頁，共244頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)23分，星期二4）互補(bǔ)的插入失活pUC載體上LacZ的5端有一段多克隆位點(diǎn)(MCS)區(qū)，本身雖不干擾LacZ的合成，但插入外源基因就會(huì)阻止LacZ的合成。不能互補(bǔ)。 lacZ 5 3 肽移碼突變lacZ 5 3 肽不互補(bǔ)互補(bǔ)MCS外源DNA第79頁，共244頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)23分，星期二 IPTG的誘導(dǎo)作用IPTG是乳糖的類似物。能誘導(dǎo)lac操縱子的啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄，使受體菌基因組中的lacZ 的C端部分和載體的lacZ肽都表達(dá)。從而互

32、補(bǔ)。但載體MCS上插入外源DNA后，仍然不能產(chǎn)生肽！IPTG第80頁，共244頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)23分，星期二通過看培養(yǎng)皿上的菌斑的顏色就能直接知道是否有DNA插入。MCS無插入時(shí)，互補(bǔ)，藍(lán)菌斑。 MCS有插入時(shí)，不互補(bǔ)，白菌斑。IPTG誘導(dǎo)的結(jié)果：第81頁，共244頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)23分，星期二無質(zhì)粒的 受體菌-半乳糖苷酶部分缺失，不能分解Xgal；無抗菌素抗性在含抗菌素和Xgal的培養(yǎng)基上培養(yǎng)無菌斑生長質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的受體菌-半乳糖苷酶的缺失被載體產(chǎn)物互補(bǔ)，能分解Xgal。且有抗菌素抗性在含抗菌素和Xgal的培養(yǎng)基上培養(yǎng)有藍(lán)色菌斑生長帶外源DNA插入的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的

33、受體菌載體產(chǎn)物失活，不能互補(bǔ)-半乳糖苷酶的缺失。不能分解Xgal，但有抗菌素抗性在含抗菌素和Xgal的培養(yǎng)基上培養(yǎng)有白色菌斑生長第82頁，共244頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)23分，星期二第83頁，共244頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)23分，星期二（5）pUC系列載體的優(yōu)點(diǎn) 更小的分子量：如pUC18為2682bp，pUC8為2750bp。 選擇方便Xgal顯色、抗菌素雙重直接選擇。 克隆便利具有多克隆位點(diǎn)（MCS），使有兩個(gè)不同粘性末端的外源DNA方便地插入。 測序方便第84頁，共244頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)23分，星期二pUC的MCS與M13噬菌體載體的MCS完全相

34、同，便于把外源DNA轉(zhuǎn)移到M13載體上測序。M13mp18的多克隆位點(diǎn)pUC18的多克隆位點(diǎn)第85頁，共244頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)23分，星期二六、其它質(zhì)粒載體1. pGEM-3Z由pUC派生而來。與pUC的主要區(qū)別是在MCS的兩側(cè)分別加了一個(gè)噬菌體啟動(dòng)子T7和SP6。T7啟動(dòng)子SP6啟動(dòng)子MCSlacZ Amprori可被T7和SP6的RNA聚合酶識(shí)別轉(zhuǎn)錄。第86頁，共244頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)23分，星期二 如果加入純化的T7或SP6 RNA聚合酶，在試管里就可以轉(zhuǎn)錄mRNA 外源基因正接反接都可以轉(zhuǎn)錄。 MCS與pUC18的完全一樣。2. pGEM-4Z：與p

35、GEM-3Z相同，只是T7啟動(dòng)子和SP6啟動(dòng)子的位置互換。pGEM-3Z的特點(diǎn)：第87頁，共244頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)23分，星期二3. 穿梭質(zhì)粒載體（1）穿梭質(zhì)粒載體的結(jié)構(gòu)人工構(gòu)建的、具有兩種不同復(fù)制起點(diǎn)和選擇標(biāo)記、可以在兩種不同的寄主細(xì)胞中存活和復(fù)制的質(zhì)粒載體。（shuttle plasmid vectors）第88頁，共244頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)23分，星期二Yeast復(fù)制起點(diǎn)E.coli復(fù)制起點(diǎn)E.coli選擇標(biāo)記Yeast選擇標(biāo)記MCS大腸桿菌枯草桿菌穿梭載體 大腸桿菌釀酒酵母穿梭載體 大腸桿菌動(dòng)物細(xì)胞穿梭載體（2）常用的穿梭質(zhì)粒載體第89頁，共244頁，

36、2022年，5月20日，22點(diǎn)23分，星期二（3）穿梭載體的優(yōu)點(diǎn) 也能利用其它細(xì)胞系統(tǒng)（酵母、枯草桿菌、哺乳動(dòng)物細(xì)胞等）進(jìn)行基因表達(dá)。 可以自如地在兩種不同寄主細(xì)胞之間來回轉(zhuǎn)移基因?？寺　?gòu)建表達(dá)E.coliAnimal cell 利用大腸桿菌進(jìn)行基因克隆、表達(dá)第90頁，共244頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)23分，星期二4、TA克隆載體 原理：Taq酶特點(diǎn) 研制出了一種線形質(zhì)粒，其3 端各帶一個(gè)不配對脫氧胸腺嘧啶核苷（T），采用該質(zhì)粒可將PCR產(chǎn)物以TA連接的方式直接進(jìn)行克隆，即TA克隆。用于TA克隆的載體被稱為TA克隆載體。 第91頁，共244頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)23分，

37、星期二第92頁，共244頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)23分，星期二T vector的克隆過程簡便！AATTT vectorPCR productT4 DNA ligaseAA第93頁，共244頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)23分，星期二 環(huán)化的質(zhì)?？寺≥d體 TA克隆載體姜穎等人于2000年提出了一般質(zhì)?？寺≥d體改造成TA克隆載體的方法。第94頁，共244頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)23分，星期二（1）克隆載體線性化。限制性核酸內(nèi)切酶酚/氯仿抽提乙醇沉淀10000r/min5min離心雙蒸水溶解第95頁，共244頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)23分，星期二（2）克隆載體末端補(bǔ)

38、平反應(yīng)。雙蒸水溶解加入dNTP(5mmol/L) 0.8lKlenow緩沖液2lKlenow酶1l加水補(bǔ)齊至20l37C溫育3h酚/氯仿抽提乙醇沉淀4以10000r /min離心5min雙蒸水溶解第96頁，共244頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)23分，星期二（3）克隆載體末端加T反應(yīng)。雙蒸水溶解MgCl2(25mmol/L)3ll,Taq酶緩沖液5ldTTP(20mmol/L) 2.5lTapDNA聚合酶1l加水至50l75溫育2h酚/氯仿抽提乙醇沉淀4以10000r/ min離心5min雙蒸水溶解第97頁，共244頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)23分，星期二注意:改造后的克隆載體與P

39、CR產(chǎn)物連接后，將克隆載體線性化的限制性核酸內(nèi)切酶位點(diǎn)外的序列已經(jīng)改變，不能再為該酶所識(shí)別。如果用產(chǎn)生平末端的限制性核酸內(nèi)切酶消化環(huán)形質(zhì)粒，即可不必經(jīng)過Klenow酶的補(bǔ)平反應(yīng)。第98頁，共244頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)23分，星期二七、質(zhì)粒載體的不穩(wěn)定性1. 質(zhì)粒穩(wěn)定遺傳必須的兩個(gè)條件：（1）每個(gè)世代、每個(gè)質(zhì)粒至少要復(fù)制一次（2）在細(xì)胞分裂時(shí)，復(fù)制過的質(zhì)粒必須分 配到兩個(gè)子細(xì)胞中。第99頁，共244頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)23分，星期二有主動(dòng)分配和隨機(jī)分配兩種假說。（1）主動(dòng)分配天然質(zhì)粒。2. 質(zhì)粒分配方式具有一個(gè)控制質(zhì)?？截惙峙涞墓δ軈^(qū)（Par），能以主動(dòng)分配的方式確保

40、質(zhì)粒能正確分配到兩個(gè)子細(xì)胞中。第100頁，共244頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)23分，星期二人工構(gòu)建的質(zhì)粒載體缺失了par區(qū)，只能以隨機(jī)分配方式分到子細(xì)胞中。人工質(zhì)粒。（一般情況下也能保證質(zhì)粒的穩(wěn)定遺傳）（2）隨機(jī)分配但在一定條件下會(huì)出現(xiàn)質(zhì)粒丟失的現(xiàn)象。第101頁，共244頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)23分，星期二在寄主菌細(xì)胞分裂的過程中，有一個(gè)細(xì)胞沒有獲得質(zhì)粒拷貝，并最終繁殖成無質(zhì)粒的優(yōu)勢群體。3. 分離的不穩(wěn)定性（segregation instability）第102頁，共244頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)23分，星期二4. 結(jié)構(gòu)的不穩(wěn)定性（structural ins

41、tability）寄主基因組的IS序列插入質(zhì)粒、質(zhì)粒間的同源重組等都會(huì)使質(zhì)粒發(fā)生插入或缺失。ISdimer重組第103頁，共244頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)23分，星期二（1）新陳代謝負(fù)荷：5. 影響質(zhì)粒載體穩(wěn)定性的主要因素使寄主細(xì)胞生長減緩：質(zhì)粒載體使寄主的世代時(shí)間延長約15%。 復(fù)制負(fù)荷減緩的程度與質(zhì)粒的分子量成正比。 轉(zhuǎn)錄和翻譯負(fù)荷丟失質(zhì)粒的細(xì)胞反而會(huì)成為優(yōu)勢群體！第104頁，共244頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)23分，星期二每個(gè)菌體中所擁有的質(zhì)?？截悢?shù)不完全相同，稱差度。（2）質(zhì)粒載體的拷貝數(shù)低拷貝數(shù)的質(zhì)粒的差度小，遺傳穩(wěn)定。差度（variance）：是產(chǎn)生無質(zhì)粒細(xì)胞的重

42、要原因。高拷貝數(shù)的質(zhì)粒載體差度大，擁有少量拷貝數(shù)的菌體多，發(fā)生丟失的可能性大。第105頁，共244頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)23分，星期二野生型E.coli中，質(zhì)粒在寄主的重組酶作用下會(huì)發(fā)生重組形成二聚體質(zhì)粒。（3）寄主菌的重組體系二聚體災(zāi)難（dimer catastrophe）：含有大分子量插入片段的質(zhì)粒載體普遍能形成質(zhì)粒寡聚體。二聚體質(zhì)粒的復(fù)制速度是單體的二倍！導(dǎo)致質(zhì)粒失控。第106頁，共244頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)23分，星期二第二節(jié) 噬菌體載體 噬菌體是一類細(xì)菌病毒（Bacteriophage）。一、噬菌體的一般特性結(jié)構(gòu)： 蛋白質(zhì)外殼內(nèi)包裹著DNA（雙鏈、單鏈、線性

43、、環(huán)狀等）。第107頁，共244頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)23分，星期二single linear DNA (about 182,000 bp)T2 Genomic DNA第108頁，共244頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)23分，星期二T4 Bacteriophage護(hù)套第109頁，共244頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)23分，星期二分為兩種：1. 溶菌周期：二、噬菌體的生活周期感染細(xì)菌后立即在菌體內(nèi)復(fù)制和合成蛋白質(zhì)外殼，重新組裝成噬菌體顆粒，并導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞解體，釋放出大量子代噬菌體。烈性噬菌體（virulent phage)第110頁，共244頁，2022年，5月20日，22

44、點(diǎn)23分，星期二第111頁，共244頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)23分，星期二第112頁，共244頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)23分，星期二2. 溶原周期：感染細(xì)菌后，將自己的DNA整合到細(xì)菌的染色體DNA中。形成這一過程稱為溶源化（lysogenization)。整合到細(xì)菌染色體的噬菌體DNA稱為原噬菌體，隨細(xì)菌的染色體復(fù)制而復(fù)制。溫和噬菌體（temperate phage)原噬菌體（prophage)：第113頁，共244頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)23分，星期二第114頁，共244頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)23分，星期二三、單鏈?zhǔn)删w載體 M13、f1、fd 噬

45、菌體單鏈環(huán)狀DNA的絲狀大腸桿菌噬菌體：M13 噬菌體第115頁，共244頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)23分，星期二（2）復(fù)制型（RF）是雙鏈環(huán)狀DNA。1. 單鏈DNA噬菌體的特點(diǎn)（3）RF DNA和ssDNA都能轉(zhuǎn)染感受態(tài) 大腸桿菌。并產(chǎn)生噬菌斑。（5）可產(chǎn)生大量的含有外源DNA插入片 段的單鏈分子，便于作探針或測序。（1）+DNA。（ssDNA）（4）不存在包裝限制。第116頁，共244頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)23分，星期二2. M13 噬菌體RF dsDNA在寄主細(xì)胞內(nèi)以高拷貝形式存在。成熟的噬菌體里只包裝有 + DNA，也容易提取。M13噬菌體只感染雄性大腸桿菌。 但

46、M13 DNA可以轉(zhuǎn)染雌性大腸桿菌。6407 bp。（2）DNA長度（3）DNA提純（1）寄主第117頁，共244頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)23分，星期二M13序列第118頁，共244頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)23分，星期二（4）M13的生活周期雖然不導(dǎo)致溶菌，但使菌斑混濁（細(xì)菌生長變慢，約為正常的1/23/4）M13通過雄性細(xì)菌的F性須注入其+DNA+DNA合成DNA，形成RF dsDNADNA轉(zhuǎn)錄mRNA、合成+DNA、翻譯形成噬菌體蛋白組裝成新的噬菌體M13，擠出寄主細(xì)胞第119頁，共244頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)23分，星期二+DNA-DNAmRNAM13外殼

47、蛋白組裝成子代M13+DNA注入大腸桿菌復(fù)制轉(zhuǎn)錄翻譯+DNA指導(dǎo)合成+DNA200個(gè) RF DNA每個(gè)細(xì)胞可以放出約1000個(gè)M13顆粒！第120頁，共244頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)23分，星期二M13噬菌體包裝DNA分子的能力可達(dá)M13DNA長度的6倍。（5）沒有包裝限制第121頁，共244頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)23分，星期二3. M13載體的構(gòu)建：M13基因組中只有基因II與基因IV之間存在一段507bp的基因間隔區(qū)。（1）克隆區(qū)域的選定 基因間隔區(qū)（intergenic region, IG區(qū)）IG區(qū)內(nèi)只有一個(gè) BsuI 切點(diǎn)。其余9個(gè)BsuI限制性位點(diǎn)分布在其它部

48、位。 酶切位點(diǎn)第122頁，共244頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)23分，星期二M13J. Messing證明，IG區(qū)存在M13的復(fù)制起點(diǎn)，但可以插入外源DNA而不影響M13噬菌體的活力。第123頁，共244頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)23分，星期二在IG區(qū)內(nèi)插入一個(gè)大腸桿菌的LacZ（-肽序列)。 利用-肽序列中的三個(gè)單一酶切位點(diǎn)（Bgl II、Ava II 和 Pvu I）。（2）加入酶切位點(diǎn) 在IG區(qū)內(nèi)加入單一內(nèi)切酶位點(diǎn)第一個(gè)M13載體：M13mp1：第124頁，共244頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)23分，星期二M13 RFBsuI不完全消化各種長度的線性片段（其中應(yīng)有只在

49、IG上切開的線性全長M13）E.coli lac基因的Hind II 片段(lacI、lacP、lacO、lacZ）連接M13mp1JM101宿主只有在IG區(qū)插入lacZ才能存活并在Xgal上出現(xiàn)互補(bǔ)的藍(lán)噬菌斑第125頁，共244頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)23分，星期二（3）M13載體系列加上常用的酶切位點(diǎn)。 M13載體系列的命名M13mpn n代表系列數(shù)字 對M13mp1的改進(jìn)B. Gronenborn和J. Messing1978年把LacZ 5端的第16個(gè)核苷酸G突變成A，產(chǎn)生了一個(gè)EcoR I切點(diǎn)。M13mp2：第126頁，共244頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)23分，星期

50、二5ATGACCATGATTACGGATTCA-Me用N-甲基-N-亞硝基脲 把G甲基化 5ATGACCATGATTACGGATTCA-轉(zhuǎn)染E.coli。mG與T配對，復(fù)制兩次后 5ATGACCATGATTACGAATTCA-EcoRI切點(diǎn)用EcoRI切M13mp1M13mp2選擇能切開的 線性分子再環(huán)化M13mp1第127頁，共244頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)23分，星期二 對M13mp2的進(jìn)一步改進(jìn)在M13mp2的LacZ的5端加上一段人工合成的多克隆位點(diǎn)（MCS）。M13mp7、M13mp8、M13mp9、M13mp10、M13mp11、M13mp18、M13mp19對應(yīng)有相同M

51、CS的pUC系列載體：pUC7、pUC8、pUC9、pUC10、pUC11、pUC18、pUC19成為M13mp系列載體：第128頁，共244頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)23分，星期二第129頁，共244頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)23分，星期二12第130頁，共244頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)23分，星期二與pUC18相同M13mp18的多克隆位點(diǎn)第131頁，共244頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)23分，星期二4. M13系列載體的優(yōu)點(diǎn)（1）有MCS，便于克隆不同的酶切片段（2） Xgal顯色反應(yīng)，可供直接選擇（3）無包裝限制，克隆能力大（4）可以克隆雙鏈DNA分子中

52、的每一條鏈子代M13噬菌體中包含的是單連+DNA。第132頁，共244頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)23分，星期二MCS+-+-+-編碼鏈非編碼鏈外源DNA不同的酶切不同的酶切插入M13 vector第133頁，共244頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)23分，星期二M13 RF+-+-+-外源DNA轉(zhuǎn)染E. coli成熟的子代M13中+第134頁，共244頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)23分，星期二 插入外源DNA后，遺傳穩(wěn)定性顯著下降 實(shí)際克隆能力小于1500bp。雖無包裝限制，并非無限包裝！5. M13載體的缺點(diǎn)第135頁，共244頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)23分，星期二

53、6. 噬菌粒載體（phagemid vectors）由質(zhì)粒載體與單鏈?zhǔn)删w載體的復(fù)制起點(diǎn)結(jié)合而成的新型載體系列。MCS噬菌體ori質(zhì)粒oriAmprlacZ lacI第136頁，共244頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)23分，星期二約3000bp（比M13小）克隆能力大能插入10kb的外源DNA。兩種復(fù)制形式分子量小（1）噬菌粒載體的特點(diǎn)既具有質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn)，又具有噬菌體的復(fù)制起點(diǎn)。既能在大腸桿菌中以質(zhì)粒的形式雙鏈復(fù)制，又能在噬菌體內(nèi)進(jìn)行單鏈復(fù)制。第137頁，共244頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)23分，星期二（2）常見的噬菌粒載體噬菌粒載體質(zhì)粒部分單鏈?zhǔn)删w部分輔助噬菌體大腸桿菌寄主p

54、EMBL8pUC8f1IR171/18pRSA101VXM13M13變異株XS127，XS101pUC118/pUC119pUC18/ pUC19M13M13K07MV1184pBSpUCf1M13K07XL1-Blue輔助噬菌體用來復(fù)制和包裝噬菌粒載體。第138頁，共244頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)23分，星期二（3）pUC118/pUC119 構(gòu)成1）M13的基因間隔區(qū)（IG）2）pUC18/pUC19質(zhì)粒載體：帶有M13復(fù)制起點(diǎn)。質(zhì)粒復(fù)制起點(diǎn) Ampr lacZ MCS第139頁，共244頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)23分，星期二MCSpUC18/pUC19 oriAmpr

55、lacZ lacIM13 ori3.2kbpUC118/119第140頁，共244頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)23分，星期二 pUC118/119的復(fù)制模式兩種不同的復(fù)制模式1）雙鏈質(zhì)粒復(fù)制模式受pUC本身的復(fù)制起點(diǎn)（來源于ColE1）的控制。每個(gè)細(xì)胞能達(dá)到500個(gè)拷貝。第141頁，共244頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)23分，星期二來源于M13的復(fù)制起點(diǎn)被輔助噬菌體的基因II產(chǎn)物控制。2）單鏈滾環(huán)噬菌體復(fù)制模式外殼蛋白復(fù)制蛋白輔助M13包裝當(dāng)寄主細(xì)胞被輔助噬菌體M13感染后。第142頁，共244頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)23分，星期二 噬菌粒載體的包裝1）輔助噬菌體：自身的

56、復(fù)制起點(diǎn)發(fā)生了突變，復(fù)制效率低下，但感染細(xì)菌后能表達(dá)出外殼蛋白和復(fù)制蛋白，幫助噬菌粒載體復(fù)制。如M13K07等。2）包裝：輔助噬菌體外殼蛋白和 復(fù)制蛋白噬菌粒載體ssDNA噬菌體第143頁，共244頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)23分，星期二（4）pBluescript 噬菌粒載體（pBS）Stratagene公司發(fā)展的一類噬菌粒載體。由pUC質(zhì)粒載體、f1噬菌體的復(fù)制起點(diǎn)和T3、T7噬菌體的啟動(dòng)子組成。 特點(diǎn) 組成MCS兩側(cè)分別加上T3和T7噬菌體的啟動(dòng)子。加入適當(dāng)?shù)氖删wRNA聚合酶，就可以定向體外轉(zhuǎn)錄。1）定向體外轉(zhuǎn)錄第144頁，共244頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)23分，星期

57、二2）兩種復(fù)制模式既能以質(zhì)粒的形式復(fù)制，又能以噬菌體的形式復(fù)制包裝。3）選擇方便有Ampr和lacZ，可以進(jìn)行Amp抗性選擇和Xgal-IPTG藍(lán)白斑選擇。4）插入方便18個(gè)單一酶切位點(diǎn)的MCS第145頁，共244頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)23分，星期二SK：表示lacZ的轉(zhuǎn)錄方向是沿MCS上的 SacI KpnI +（f1+）：單鏈復(fù)制起始方向背離 lacZ，能回收lacZ的編碼鏈（+）pBluescript SK（+/-）/pBluescript KS（+/-）KS：反向（ KpnI SacI ，MCS相反）-（f1-）：能回收lacZ的非編碼鏈（-）1）pBluescript S

58、K/KS（+/-）區(qū)分： 常用的 pBluescript 載體第146頁，共244頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)23分，星期二pBS SK+第147頁，共244頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)23分，星期二pBS KS-第148頁，共244頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)23分，星期二（5）噬菌粒T 載體pCR系列載體Invitrogen公司開發(fā)的線性噬菌粒載體。 結(jié)構(gòu)pUC的質(zhì)粒部分、 f1噬菌體ori、Kanr和Ampr抗性。MCS的中部已經(jīng)切開，各有一個(gè)3端突出的T。 特點(diǎn)PCR產(chǎn)物往往在3端突出一個(gè)A，所以能與這個(gè)載體直接連接。第149頁，共244頁，2022年，5月20日，2

59、2點(diǎn)23分，星期二pCR2.1第150頁，共244頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)23分，星期二pCR2.1的MCS克隆的PCR產(chǎn)物能被兩側(cè)的EcoRI切下來回收。第151頁，共244頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)23分，星期二Promega 公司T載體系列pGEM-T vectorpGEM-T Easyvector第152頁，共244頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)23分，星期二pTarget vectorG418抗性可在真核生物表達(dá)pTARGETTM載體包含巨細(xì)胞病毒CMV早期增強(qiáng)子/啟動(dòng)子，可啟動(dòng)基因在多種細(xì)胞中高水平表達(dá)。這個(gè)載體還包含一個(gè)新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(Neo)，可用抗

60、生素G- 418篩選細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)株。 Promega 公司T載體系列第153頁，共244頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)23分，星期二7. 噬菌體展示載體（ Phage display vector）（1）噬菌體展示（Phage display）將外源蛋白（多肽、酶、抗體、DNA結(jié)合蛋白）結(jié)合到噬菌體的外殼蛋白上形成融合蛋白，表達(dá)于噬菌體的外表面。G. P. Smith1985年發(fā)明。絲狀噬菌體（M13、f1等）外殼顆粒的一端，有3-5個(gè)基因編碼的蛋白質(zhì)（g3p），在識(shí)別和吸附大腸桿菌的過程中起作用。第154頁，共244頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)23分，星期二M13第155頁，共24