高效液相色譜儀的原理及應(yīng)用

1、高效液相色譜儀的原理及應(yīng)用2022/9/25一、高效液相色譜法的定義和分類流動(dòng)相是液體的色譜稱為液相色譜（LC）。在液相色譜中，采用顆粒十分細(xì)的高效固定相，并采用高壓泵輸送流動(dòng)相，全部工作通過(guò)儀器完成，這種色譜稱為高效液相色譜（HPLC） 。第一節(jié) 高效液相色譜法原理2022/9/25一、高效液相色譜法的定義和分類液相色譜：平板色譜和柱色譜。液相色譜：分配色譜、液固色譜、離子交換色譜、尺寸排阻色譜。氣相色譜：揮發(fā)性物質(zhì)，不能用于熱不穩(wěn)定物質(zhì)分析。液相色譜：可分析各種物質(zhì)，熱不穩(wěn)定物質(zhì)，但流動(dòng)相有毒，運(yùn)行操作比GC難。能用GC就用GC。 2022/9/25二、液相色譜中常用術(shù)語(yǔ)和參數(shù)只針對(duì)HPL

2、C特有的，其余術(shù)語(yǔ)與第三章同。粒間體積（V0）：色譜柱填充劑顆粒間隙中流動(dòng)相所占有的體積?？左w積（Vp） ：色譜柱中多孔填充劑的所有孔洞中流動(dòng)相所占有的體積。2022/9/25二、液相色譜中常用術(shù)語(yǔ)和參數(shù)柱外體積（Vext）：從進(jìn)樣系統(tǒng)到檢測(cè)器之間色譜柱以外的液路部分中流動(dòng)相所占有的體積。液體總體積（Vtot） ：粒間體積、孔體積和柱外體積之和。淋洗體積（V） ：從進(jìn)樣開(kāi)始計(jì)算的通過(guò)色譜柱的實(shí)際淋洗體積。2022/9/25三、反相高效液相色譜 由非極性固定相和極性流動(dòng)相所組成的液相色譜體系。其代表性的固定相是十八烷基鍵合硅膠(ODS柱），代表性的流動(dòng)相是甲醇和乙腈。是當(dāng)今液相色譜的最主要分離模

3、式。溶質(zhì)在填料表面的烴類和流動(dòng)相之間進(jìn)行分配。溶質(zhì)在吸附于填料表面烴類上的“改良固定相”和流動(dòng)相之間進(jìn)行分配溶質(zhì)被吸附于填料表面烴類分子上，類似吸附色譜。2022/9/25四、正相高效液相色譜是由極性固定相和非極性（或弱極性）流動(dòng)相所組成的HPLC體系。其代表性的固定相是改性硅膠、氰基柱等，代表性的流動(dòng)相是正己烷。吸附色譜也屬正相HPLC。溶劑洗脫強(qiáng)度近似地隨溶劑的介電常數(shù)增加而增大，洗脫能力越弱，溶質(zhì)在柱上保留時(shí)間越長(zhǎng)。2022/9/25第二節(jié) 高效液相色譜儀的組成Agilent 11002022/9/251.輸液系統(tǒng)2.進(jìn)樣系統(tǒng)3.分離系統(tǒng)4.檢測(cè)系統(tǒng)5.數(shù)據(jù)處理 系統(tǒng)一 高效液相色譜儀系

4、統(tǒng)高壓泵流動(dòng)相溶劑廢液色譜柱進(jìn)樣口檢測(cè)器2022/9/251、輸液系統(tǒng) 貯液裝置 脫氣裝置高壓輸液泵梯度淋洗系統(tǒng)輸液系統(tǒng)的功能: 1.提供足夠的驅(qū)動(dòng)力使流動(dòng)相通過(guò)填充柱 2.使流動(dòng)相流量精確和穩(wěn)定 3.使流動(dòng)相組成精確2022/9/25 分析用高效液相色譜的流動(dòng)相貯罐，常用1L的錐形瓶加一個(gè)電磁攪拌器，在連接到泵入口處的管線上要加一個(gè)過(guò)濾器。 (1) 貯液裝置 2022/9/25(2) 脫氣裝置 用于脫去流動(dòng)相中的溶解氣體，流動(dòng)相先經(jīng)過(guò)脫氣裝置再輸送到色譜柱。 脫氣機(jī)、超聲脫氣、真空脫氣等。 2022/9/25(3) 高壓輸液泵主要部件之一，壓力：150350105 Pa。為了獲得高柱效而使用

5、粒度很小的固定相（ 甲酰胺 乙腈 甲醇 乙醇 丙醇 丙酮 二氧六環(huán) 四氫呋喃 甲乙酮 正丁醇 乙酸乙酯 乙醚 異丙醚 二氯甲烷氯仿溴乙烷苯四氯化碳二硫化碳環(huán)己烷己烷煤油(最小)2022/9/25 1、環(huán)境中有機(jī)氯農(nóng)藥殘留量分析 固定相：薄殼型硅膠(37 50m) 流動(dòng)相：正己烷 流 速：1.5 mL/min 色譜柱：50cm2.5mm(內(nèi)徑) 檢測(cè)器：折光示差檢測(cè)器 可對(duì)水果、蔬菜中的農(nóng)藥殘留量進(jìn)行分析。第三節(jié) HPLC的應(yīng)用2022/9/252、稠環(huán)芳烴的分析 稠環(huán)芳烴多為致癌物質(zhì)。 固定相：十八烷基硅烷化鍵合相 流動(dòng)相：20%甲醇-水 100%甲醇 線性梯度淋洗，2%/min 流 速：1m

6、L/min 柱 溫：50 C 柱 壓：70 104 Pa 檢測(cè)器：紫外檢測(cè)器2022/9/25例：液相色譜法測(cè)定食品中苯并(a)芘原理： 樣品經(jīng)過(guò)提取、皂化以及柱層析凈化，除去脂肪類物質(zhì)、色素等雜質(zhì)后，再通過(guò)液相色譜儀中的色譜柱，將苯并芘從多環(huán)芳烴物質(zhì)中分離出來(lái)。求出樣品中苯并芘的含量。儀器： (1)液相色譜儀： 色譜柱：ODS柱，柱長(zhǎng)250mm，4mm； 柱溫：30； 流動(dòng)相：75甲醇； 流速：2mLmin。 (2)檢測(cè)器：熒光檢測(cè)器，激發(fā)波長(zhǎng)369nm，熒光波長(zhǎng)405nm。2022/9/25操作步驟： (1) 定性測(cè)定 用微量注射器吸取一定量的苯并芘標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣液，注入色譜儀內(nèi)，根據(jù)苯并芘

7、的出峰保留時(shí)間和樣品中加標(biāo)準(zhǔn)樣產(chǎn)生重疊的情況進(jìn)行定性。 (2) 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 用微量注射器準(zhǔn)確吸取每1mL含1g的苯并芘標(biāo)準(zhǔn)溶液1、2、3、4、5uL按照上述實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行操作，以獲得相應(yīng)的色譜圖。然后，分別測(cè)量各個(gè)色譜的峰面積。以峰面積為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)苯并芘量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。 (3) 樣品的測(cè)定： 在上述實(shí)驗(yàn)條件下，吸取一定量經(jīng)過(guò)柱凈化的樣品提取液，注入液相色譜儀中進(jìn)行分離、分析，測(cè)得峰面積，然后從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出相應(yīng)于此面積的苯并芘含量。2022/9/25 Waters 515高效液相色譜泵，Waters 717自動(dòng)進(jìn)樣器，Waters 2487雙波長(zhǎng)紫外檢測(cè)器，聯(lián)想數(shù)據(jù)處理機(jī)，Waters 3. 9 X 150 mm C18不銹鋼柱流動(dòng)相：甲醉、水體積比30：70 和15：85兩種， 超聲波除氣