載阿霉素紅細胞膜殼聚糖靶向納米粒的制備及評

1、載阿霉素紅細胞膜殼聚糖靶向納米粒的制備及評洪偉勇 周旭暉 金陳浩 王金明 郭鈁元 楊根生關鍵詞紅細胞膜;納米粒;葉酸受體;靶向給藥系統(tǒng);抗腫瘤惡性腫瘤嚴重威脅人類健康，化學藥物治療仍是目前主要的治療手段之一。阿霉素（doxorubicin，DOX）是最常用的化學治療藥物，對乳腺癌、肺癌、膀胱癌等具有較明顯的抗腫瘤作用，是多種腫瘤的一線化療藥物;但其具有骨髓抑制、心臟毒性、耐藥性等缺點，從而限制了其臨床應用1。紅細胞是血液中數(shù)量最多、壽命最長的細胞，也是運送氧氣的主要媒介2;其作為內(nèi)源性物質(zhì)，具有極強的流動可塑性、高生物相容性、可生物降解性、超長的半衰期和低免疫原性等優(yōu)點3 - 6;通過修飾還可

2、以將其構建成靶向腫瘤的藥物遞送系統(tǒng)7-9，現(xiàn)已成為抗腫瘤藥物研發(fā)的一個新熱點。葉酸（folic acid，F(xiàn)A）受體是公認的腫瘤細胞生物標志物，在大量腫瘤（特別是乳腺癌、宮頸癌、肝癌等多種實體瘤）中過表達7，10，而在正常細胞中很少表達，是理想的靶向藥物遞送受體11-12?；诖?，本研究以DOX為模型藥物，殼聚糖為載體材料，采用離子交換法制備載阿霉素殼聚糖納米粒（DOX-CS-NPs），將FA 和氨基聚乙二醇磷脂（NH2-PEG2000-DSPE）通過共價連接后修飾紅細胞膜（RBC），并構建靶向腫瘤細胞FA受體的載阿霉素紅細胞膜殼聚糖靶向納米粒（FA-RBC-DOX-CS-NPs），考察該納米

3、粒的理化性質(zhì)和體外釋藥特性，并評價其抗腫瘤活性，以期為DOX的新制劑開發(fā)提供參考。1 材料1.1 主要儀器本研究所用主要儀器有IL-161CT型CO2培養(yǎng)箱施都凱儀器設備（上海）有限公司，Malvern ZS90 型激光納米粒徑儀（英國馬爾文儀器有限公司），Nicolet 6700 型傅里葉變換紅外光譜儀、Fresco 21 型高速冷凍離心機（美國Thermo Fisher Scientific 公司），ELx800 型酶標儀（美國BioTek 公司），UV-2102 型紫外可見分光光度計（美國Unocal 公司），LSM 900 型共聚焦顯微鏡（德國Carl Zeiss 公司），Xpert

4、PRO 型X 射線衍射儀（荷蘭PNAlytical 公司），AVANCE-型核磁共振波譜儀（德國Bruker公司）。1.2 主要藥品與試劑FA、殼聚糖和三聚磷酸鈉（批號分別為20220607、20221009、202212110）購于上海阿拉丁生化科技有限公司;NH2-PEG2000-DSPE（批號20221022）購于上海凡碩生物科技有限公司;DOX（批號20220809）購于武漢遠成共創(chuàng)科技有限公司;DMEM 高糖培養(yǎng)基（批號19126245）購于美國Sigma 公司;MTT 試劑（批號2022316）購于北京索萊寶科技有限公司;DAPI 染色液（批號20221116）購于上海穎心實驗室設

5、備有限公司;1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亞胺鹽酸鹽（EDC，批號20220928）購于浙江普康化工有限公司;N-羥基琥珀酰亞胺（NHS，批號20220821）購于上海麥克林生化科技有限公司;其余試劑為實驗室常用規(guī)格，水為純凈水。1.3 細胞人乳腺癌MCF-7 細胞購于上海生命科學研究所細胞資源庫。1.4 動物本研究所用動物為健康雄性SD大鼠，共9 只，體質(zhì)量為180200 g，鼠齡為8 周，由浙江省醫(yī)學科學院提供，動物生產(chǎn)許可證號為SCXK（浙）2022-0002。實驗期間正常光照，動物飼養(yǎng)室環(huán)境溫度為2022 ，相對濕度為55%60%，大鼠自由飲水采食。2 方法2.1 葉酸氨基聚乙

6、二醇磷脂的合成取7.94 mg FA溶于10 mL無水二甲基亞砜（DMSO）中，加入6.9 mg EDC和4.14 mg NHS，室溫避光活化4 h，加入30 mg NH2-PEG2000-DSPE，避光，室溫反應24 h（具體合成路線見圖1），然后置于去離子水中透析（透析袋截留相對分子質(zhì)量為3 000 Da）36 h，收集產(chǎn)物并凍干，即得葉酸氨基聚乙二醇磷脂（FA-PEG2000-DSPE）。采用核磁共振氫譜（1H-NMR）表征FA、NH2-PEG2000-DSPE和FA-PEG2000-DSPE的結構。2.2 RBC的制備取SD雄性大鼠血液，加入10 倍體積的1磷酸鹽緩沖液（PBS），于4

7、 下以4 500 r/min 離心10 min，取沉淀，以1PBS洗滌3 次，即得紅細胞。將紅細胞置于4 倍體積的0.25PBS 中，于4 下低滲處理40 min，以釋放紅細胞內(nèi)容物;再以8 000 r/min 離心15 min，取沉淀，以0.25PBS洗滌2 次，即得粉色的RBC，備用。2.3 FA修飾RBC的表征取“2.1”項下FA-PEG2000-DSPE 適量，以1PBS 配制成質(zhì)量濃度為50 g/mL 的溶液（2 mL），加至等體積RBC溶液中，置于37 、100 r/min 搖床上避光孵育1 h;再于4 條件下用1PBS洗滌離心（8 000 r/min）2 次，即得FA修飾的RBC

8、（FA-RBC）。采用傅里葉變換紅外光譜儀測定RBC和FA-RBC的結構。2.4 DOX-CS-NPs的制備與表征采用離子交聯(lián)法制備DOX-CS-NPs13。在25 、400 r/min 的磁力攪拌下，于殼聚糖醋酸溶液（pH6.0）中加入DOX溶液，緩慢滴加三聚磷酸鈉溶液至產(chǎn)生乳光，繼續(xù)磁力攪拌10 min 得納米?；鞈乙?將納米粒混懸液置于超濾管（100 kDa）中離心（4 000 r/min），即得DOX-CS-NPs。其中，DOX溶液、殼聚糖醋酸溶液、三聚磷酸鈉溶液的質(zhì)量濃度分別0.5、1.5、0.4 mg/mL，體積比為5 5 4。采用激光納米粒徑儀測定該納米粒的粒徑、多分散性指數(shù)（p

9、olydisepersity index，PDI）和Zeta電位。2.5 DOX-CS-NPs包封率和載藥量的測定取適量DOX（質(zhì)量記為M）按“2.4”項下方法制備納米?；鞈乙翰⒊瑸V，取下清液，采用紫外可見分光光度計測定其中DOX 含量（記為M1）14。取超濾膜上納米粒，凍干，稱質(zhì)量（記為M2）。計算包封率和載藥量，具體公式如下：包封率（%）=（M-M1）/M100%，載藥量（%）=（M-M1）/M2100%。2.6 FA-RBC-DOX-CS-NPs的制備及表征采用細胞破碎儀處理FA-RBC（功率100 W，先破碎4 s，間隔5 s 后，再破碎5 s），將破碎后的FA-RBC 和DOX-CS

10、-NPs 經(jīng)400 nm 聚碳酸酯膜擠壓3 次后，再經(jīng)200 nm 聚碳酸酯膜擠壓5 次，即得FA-RBC-DOXCS-NPs。采用激光納米粒徑儀測定其粒徑、PDI 和Zeta電位。2.7 體外釋放特性考察分別取適量DOX、DOX-CS-NPs、FA-RBC-DOXCS-NPs 置于不同透析袋中，再將各透析袋分別置于pH7.4（模擬體循環(huán)環(huán)境）和pH6.5（模擬腫瘤微環(huán)境）的PBS溶液（釋放介質(zhì)）中，于37 、100 r/min 搖床上進行透析。在預定的時間點（1、2、4、8、12、24、48、72 h），取出10 mL釋放介質(zhì)并補充等量新鮮介質(zhì)，按“2.5”項下紫外分光光度法測定取出的釋放介

11、質(zhì)中DOX的含量，并計算累積釋放率。2.8 體外抗腫瘤活性考察取對數(shù)生長期的MCF-7 細胞，以1104個/孔接種至96 孔板中，于37 、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h 后，棄去原培養(yǎng)基，分別加入含DOX、DOX-CS-NPs、FA-RBCDOX-CS-NPs 的培養(yǎng)基（以DOX計，質(zhì)量濃度均分別為0.001、0.010、0.100、0.500、1.000、5.000 g/mL），每孔100 L，各濃度平行5 份;另設對照組（只加細胞不加藥物）。培養(yǎng)48 h 后，加入10 L MTT（5 mg/mL），繼續(xù)培養(yǎng)4 h;吸出培養(yǎng)基，加入DMSO 150 L，采用酶標儀于570 nm波長處測定各孔

12、光密度（optical density，OD）值，并計算細胞存活率，細胞存活率（%）=（給藥組平均OD值/對照組平均OD值）100%。2.9 細胞攝取實驗取對數(shù)生長期的MCF-7 細胞，以1104個/孔接種至96 孔板中，于37 、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h 后，棄去原培養(yǎng)基，分別加入含DOX、FA-RBC-DOX-CS-NPs 和FA+FA-RBC-DOX-CS-NPs（游離FA用于封閉受體以驗證納米粒的入胞作用是否由FA受體介導）的新鮮培養(yǎng)基（以DOX計，質(zhì)量濃度均為5 g/mL）;另設不加藥物的空白組。于培養(yǎng)1、4 h 時移除培養(yǎng)基，以4%多聚甲醛固定30 min;以PBS 洗滌后，用

13、10 g/mL 的DAPI 染色1 h，采用共聚焦顯微鏡觀察細胞的攝取情況。3 結果與分析3.1 FA-PEG2000-DSPE的合成結果FA、NH2-PEG2000-DSPE 和FA-PEG2000-DSPE 的1H-NMR 如圖2 圖4 所示。對比圖譜可知，圖4 中7.737.55 ppm（e）和6.756.49 ppm（f）位置的2 個峰分別對應FA苯環(huán)上的H原子;8.11 ppm（d）和6.94 ppm（g）位置的2 個峰分別對應FA 上NH基團的H 原子;4.33 ppm（b）、4.49 ppm（h）、8.65 ppm（i）位置的峰也與FA的1H-NMR相符;3.51 ppm和1.2

14、4 ppm位置的峰分別屬于NH2-PEG2000-DSPE 中C17H35、OCH2CH2 基團上的H原子。由此表明，載體材料FA-PEG2000-DSPE合成成功。3.2 FA修飾RBC的表征結果傅里葉變換紅外光譜儀檢測結果（圖5）顯示，1 601.1 、1 451.4 cm-1為FA-RBC 中FA上苯環(huán)C=C的骨架振動峰;3 294.8 cm-1歸屬于FA上的羥基;864.5 cm-1為FA苯環(huán)對位二取代的振動峰;1 156.1 cm-1為NH振動峰。由此可知，F(xiàn)A已被成功修飾至RBC上。3.3 DOX-CS-NPs的表征結果DOX-CS-NPs 的載藥量為（15.091.36）%，包封

15、率為（60.990.92）%，平均粒徑為（152.5002.554）nm，PDI 為0.1240.042，Zeta 電位為（10.1000.216）mV，其中粒徑分布和Zeta 電位見圖6。由此可知，DOX-CSNPs的粒徑較小、分布均勻。3.4 FA-RBC-DOX-CS-NPs的表征結果FA-RBC-DOX-CS-NPs 的平均粒徑為（254.200 2.651）nm，PDI為0.1990.031，Zeta 電位為（-10.1000.213）mV，具體見圖7。由于RBC 本身帶負電，DOX-CS-NPs經(jīng)FA-RBC包被后由帶正電荷轉(zhuǎn)變?yōu)閹ж撾姾?，由此可知，F(xiàn)A-RBC-DOX-CS-NP

16、s 已被成功構建。3.5 體外釋放特性考察結果由體外釋放曲線（圖8）可知，在2 種釋放條件下，DOX 原藥均釋放最快，DOX-CS-NPs 次之，F(xiàn)A-RBCDOX-CS-NPs最慢。在pH7.4 的釋放介質(zhì)中，DOX在8 h左右釋放完全，DOX-CS-NPs 在72 h 左右釋放完全，F(xiàn)A-RBC-DOX-CS-NPs 在72 h 的累積釋放率約為90%。在pH6.5 的釋放介質(zhì)中，這3 種藥物（制劑）的釋放速率均比在pH7.4 的釋放介質(zhì)中快，DOX在2 h 左右釋放完全，DOX-CS-NPs 在12 h 內(nèi)釋放完全，F(xiàn)A-RBCDOX-CS-NPs 在36 h 內(nèi)釋放完全。由此可知，DO

17、X-CSNPs和FA-RBC-DOX-CS-NPs 在模擬腫瘤微環(huán)境（pH6.5）中的釋藥速率均快于生理條件（pH7.4），這一特性可以減少藥物在體循環(huán)中的釋放，增加藥物在腫瘤組織中的釋放，從而減少副作用，增強藥物抗腫瘤療效。Evans 等15研究發(fā)現(xiàn)，在生理條件（pH7.4）下，紅細胞發(fā)生溶血的概率不大，而腫瘤微環(huán)境（pH6.5）中，紅細胞會出現(xiàn)強烈溶血。筆者推測這可能是FA-RBC-DOX-CSNPs在腫瘤微環(huán)境（pH6.5）中釋放速率顯著增加的原因之一。3.6 體外抗腫瘤活性考察結果DOX、DOX-CS-NPs、FA-RBC-DOX-CS-NPs 對MCF-7細胞增殖活力的影響見圖9。由

18、圖9 可知，當DOX質(zhì)量濃度在0.5005.000 g/mL 范圍內(nèi)，3 種藥物（制劑）對MCF-7 細胞的抑制作用均呈濃度依賴趨勢，MCF-7 細胞的增殖能力隨著DOX質(zhì)量濃度的升高而減弱。當DOX質(zhì)量濃度在0.0105.000 g/mL 范圍內(nèi)時，DOX-CSNPs和FA-RBC-DOX-CS-NPs 對MCF-7 細胞的抑制效果不如DOX明顯，這可能是由于上述2 種納米制劑將藥物包裹在納米粒內(nèi)，使其釋放速率減慢，短時間內(nèi)無法直接作用于腫瘤細胞。3.7 細胞攝取實驗結果在體外抗腫瘤活性結果的基礎上，為研究FA-RBCDOX-CS-NPs 對腫瘤細胞的靶向性和侵襲能力，考察了DOX 質(zhì)量濃度為5 g/mL 時，經(jīng)DOX、FA-RBC-DOXCS-NPs和FA+FA-RBC-DOX-CS-NPs 處理1、4 h 后DOX的入胞行為，結果見圖10。由圖10 可知，處理1 h 后，3種藥物（制劑）均被細胞攝取，但在細胞內(nèi)的濃度均較低，且差別不大。處理4 h 后，細胞內(nèi)3 種藥物（制劑）的熒光強度均增強，表明細胞對DOX的攝取隨作用時間的增加而增加;其中FA-RBC-DOX-CS-NPs 處理后的細胞的熒光強度最強，DOX次之，F(xiàn)A+FA-RBC-DOX-CS-NPs 最弱。由此可知，F(xiàn)A-RBC-DOX-CS-NPs 能主動識別腫瘤細胞表面的FA 受體并特異性結合，從而提高D