從柏科植物中分離具有抗腫瘤、抗真菌、抗菌活性的內(nèi)生真菌

1、從柏科植物中分離具有抗腫瘤、抗真菌、抗菌活性的內(nèi)生真菌摘要 最近的研究可以看出柏科植物體內(nèi)分離的內(nèi)生真菌的生物勘探情況。本篇文章主要探討健康寄主植物如柏木屬、杉屬、側(cè)柏屬體內(nèi)高活性的內(nèi)生真菌菌種。本文中，內(nèi)生鏈格孢菌、鏈格孢菌、鏈格孢屬是從健康的檜柏球體內(nèi)分離出的。內(nèi)生真菌生物活性和生物多樣性的恢復(fù)是一個生物地理學(xué)和主機(jī)標(biāo)識。我們同樣研究了鏈格孢菌的代謝產(chǎn)物，突出了他們的抗增殖、抑制生長的能力以及對稻瘟、梨火疫病菌和丁香假單胞菌等模型目標(biāo)菌的抗菌活性。總之，自從鏈格孢菌被發(fā)現(xiàn)，它們總是作為致病性和致敏真菌被報道，我們的研究表明了它們在檜柏植物葉面組織的一個可能的其它生態(tài)位。此外，在這項研究中，

2、我們還報道了柏科植物家族之間內(nèi)生鏈格孢屬的顯著的生物活性。引言目前正在對從許多寄主植物中分離物種的生物多樣性和植物內(nèi)生菌的生物活性進(jìn)行調(diào)查。最近的研究強(qiáng)調(diào)，柏科植物中寄宿了許多種類的內(nèi)生菌。我們的研究進(jìn)一步表明，柏科植物內(nèi)生菌具有一定寬度范圍的生物活性。例如，抗真菌、抗細(xì)菌和抗增殖活動。在最近幾年，已經(jīng)常證明寄主植物的內(nèi)生菌可以產(chǎn)生與寄主植物相同的生物活性分子。柏科植物家族的物種廣泛被用于藥材中。因此，由檜柏球植株體內(nèi)的內(nèi)生微生物生產(chǎn)的代謝產(chǎn)物的生物活性可能與植物本身的代謝產(chǎn)物生物活性類似。因此，一些藥物發(fā)現(xiàn)的項目表明，可以利用柏科植物體內(nèi)的一些內(nèi)生真菌來生物合成抗癌因子。因此，研究柏科植物中

3、內(nèi)生真菌的定植可能會發(fā)現(xiàn)除真菌多樣性之外的其他生物活性分子來源。鏈格孢屬的真菌（座囊菌綱、子囊菌門）廣泛分布在植物，土壤，食品，環(huán)境和室內(nèi)空氣中。鏈格孢屬物種作為植物病原菌、弱兼性寄生菌、腐生菌以及內(nèi)生菌已經(jīng)適應(yīng)了各種各樣的生活方式。特別是在免疫功能低下的人群中一些鏈格孢屬菌已成為人體的病原體，它們是人類常見的過敏原。其中哮喘，暗色絲孢霉病，灰指甲，鼻竇炎，潰瘍皮膚感染，角膜炎，內(nèi)臟感染骨髓炎都是由鏈格孢屬真菌引起的，其中鏈格孢是最常見的一種。鏈格孢菌也因為它可以制作生化藥劑的本領(lǐng)而為人類所熟知，如生產(chǎn)植物毒素和真菌毒素。在過去的幾十年里，至少有268種鏈格孢屬真菌產(chǎn)生的關(guān)于植物毒性、細(xì)胞毒性

4、和抗菌性能的生物分子被報道。據(jù)我們所知，在柏科植物中已經(jīng)有大量的真菌被報道。從崖側(cè)柏的體內(nèi)收集了斑點(diǎn)落葉病和黑斑病的內(nèi)生真菌。柏科植物家族（松柏類）廣泛分布于地球的每個角落。前面的研究展示了它們物種組成的多樣性，物內(nèi)生菌的生物活性可顯著由寄主植物或寄主植物的局部生長來影響。此外，有對對抗癌癥和傳染性疾病在人群中傳播和對植物非生物脅迫所需生物分子的持續(xù)的需要。我們組以前報道的柏科植物中內(nèi)生青霉菌和木霉屬青梅真菌的生物多樣性和生物活性。我們關(guān)聯(lián)了從柏科植物家族中分離的鏈格孢真菌的生物活性尤其是柏科植物內(nèi)生鏈格孢屬的抗增殖、抗真菌能力。材料與方法取樣地點(diǎn)與植株在伊朗不同省份的幾個地方，表明取樣的代表

5、性，分別是從法爾斯（南伊朗），桂蘭（伊朗北部），哈馬丹（伊朗西部），和 中央（伊朗中心）進(jìn)行植物材料的收集。從綠干柏、意大利柏木、刺柏棕竹、圓柏屬、側(cè)柏等植物標(biāo)本（樹枝的葉子，干皮，水果）收集（表1）。內(nèi)生真菌的獲取與鑒定用參考文獻(xiàn)里的方法從成熟的健康檜柏球植株中收集無炎癥的新鮮葉片組織。在2011年6月-10月份每一個地區(qū)取樣至少設(shè)置三個重復(fù)。從每個植物標(biāo)本中，隨機(jī)抽取三件根據(jù)參考文獻(xiàn)進(jìn)行表面消毒，共820植物碎片孵育在PDA固體培養(yǎng)基或水瓊脂培養(yǎng)基中（WA），在26-28放置2-12周，從生長的菌絲頂端分離真菌并進(jìn)行純化，4保存。內(nèi)生鏈格孢分離株的鑒定是通過研究其菌落形態(tài)和產(chǎn)孢PCA機(jī)制（

6、土豆胡蘿卜瓊脂培養(yǎng)基）來實(shí)現(xiàn)的，在16/8光照黑暗間隔22-25放置7d。根據(jù)參考文獻(xiàn)，對真菌標(biāo)本進(jìn)行染色，在顯微鏡下觀察。生物測定模式細(xì)菌和真菌使用模式目標(biāo)菌稻瘟病真菌HS-1390和目標(biāo)植物病原芽孢桿菌來檢測鏈格孢菌代謝產(chǎn)物提取提取的抗增殖和抗菌活性物質(zhì)。歐文式菌、假單胞菌由A. Ghasemi植物研究所提供。在體外首先利用稻瘟病菌對內(nèi)生真菌菌株活性進(jìn)行初步測試，然后再利用其它的松柏植物病原病菌。色二孢屬真菌、Spencermartinsia viticola等來自庫爾德斯坦大學(xué)，伊朗。子囊菌門以及所有的真菌和細(xì)菌菌株都在4長期保存。鏈格孢菌的代謝產(chǎn)物提取對細(xì)胞內(nèi)外代謝產(chǎn)物的提取按照之前的

7、方法進(jìn)行。簡單來說，將鏈格孢菌株接種于馬鈴薯葡萄糖肉湯（PDB）中，在28、120r/min、黑暗條件下培養(yǎng)15d。然后將培養(yǎng)液用甲醇提取，將發(fā)酵液過濾得到胞外代謝產(chǎn)物。然后將有機(jī)溶劑和甲醇按照1:1的比例添加到過濾后的培養(yǎng)液中，然后將其轉(zhuǎn)移到4條件下12h來去除蠟質(zhì)材料。采集有機(jī)相，采用50條件下蒸發(fā)有機(jī)溶劑。干燥的甲醇抽提物溶解在蒸餾水或DMSO中使其終濃度為250lg/mL。最后在測定生物活性前過直徑為0.22微米濾膜。對于胞內(nèi)代謝產(chǎn)物，先獲取菌絲體的生物量，洗干凈后，浸入1:5甲醇中2天。菌絲均勻分布。上清液進(jìn)行進(jìn)一步處理，方法同獲取胞外代謝產(chǎn)物。生化分析前，將次生代謝產(chǎn)物放置到-20

8、冰箱中?？乖鲋硿y定鏈格孢菌抗增殖的/細(xì)胞毒性的內(nèi)外代謝產(chǎn)物以檢測稻瘟病菌分生孢子的萌發(fā)為模型。稻瘟病分生孢子懸濁液(4.9x104 mL-1;0.02%酵母提取物/50mL)接種在96孔板上。樣品提取液（50ml）通過連續(xù)稀釋到最終濃度為250, 125, 62.5, 31.25, 15.62, and 7.81 lg mL-1.，添加到每個孔內(nèi)。檢測板在24條件下培養(yǎng)16h，將每個樣品的提取液，起源于75分生孢子種子的萌發(fā)和芽管的尺寸放在顯微鏡下觀察，與對照相比獲取最低的抑菌濃度（MIC檢測）。試驗設(shè)置三個重復(fù)?？咕鷮?shí)驗體外抗真菌鏈格孢屬菌株使用稻瘟病菌進(jìn)行初步測定，然后再通過對霜霉病菌等進(jìn)

9、行實(shí)驗。本試驗將鏈格孢屬真菌與每一個目標(biāo)真菌接種到PDA平板上。將鏈格孢屬取5mm菌絲盤在28條件下在平板的一側(cè)傳代培養(yǎng)。當(dāng)鏈格孢菌覆蓋了整個平板一半的面積時，將目標(biāo)菌株接種在平板的另一側(cè)，置于28條件下培養(yǎng)。隨著目標(biāo)真菌的日益生長，在每個鏈格孢菌存在的平板都與對照組相對照，直至對照組真菌長滿整個平板?？拐婢饔玫拇笮∈峭ㄟ^測定抑制區(qū)相對于對照組的直徑來衡量的，通過以下公式計算生長抑制率：生長抑制率（%）=（對照組直徑-處理組直徑）/對照組*100%。抑菌（MIC）和殺菌（MBC）的測定利用離火疫病菌和丁香假單胞菌等來衡量細(xì)胞內(nèi)外代謝產(chǎn)物的抗菌活性。首先獲得1x106 cfu/mL的細(xì)菌生長液

10、，然后在肉湯培養(yǎng)基（NB）中利用肉湯稀釋法進(jìn)行抗菌檢測。將檢測板放置在28條件下培養(yǎng)16h，觀察和比較目標(biāo)細(xì)菌的生長情況來進(jìn)行抑菌和殺菌測定。實(shí)驗設(shè)置三個重復(fù)。以IC80值的獲取和展示代謝產(chǎn)物具有80%體外抑制作用的濃度。統(tǒng)計分析利用SAS軟件對進(jìn)行抗真菌實(shí)驗獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析（ANOVA）及最小顯著差異試驗（LSD）。不同處理之間的顯著差異水平為5%（P0.05）結(jié)果鏈格孢菌物種的宿主標(biāo)示、生物地理學(xué)和物種多樣性從生長在伊朗四省的綠干柏、意大利柏木、刺柏棕竹、圓柏屬、側(cè)柏等植物上采集了820個植物標(biāo)本。從宿主標(biāo)本植物中得到110株真菌（13.4%定植率），包含了19個真菌屬的35種真菌，

11、其中鏈格孢菌占7.7%?？偟膩碚f，得到了8株鏈格孢屬的菌株。此外，內(nèi)生鏈格孢菌住只在法爾斯（南伊朗），哈馬丹（伊朗西部）Cupressus arizonica, Cupressus sempervirens var. cereiformis 物種中發(fā)現(xiàn)（表1）。由此可見，鏈格孢菌屬主要存在于法爾斯省側(cè)柏的枝葉中，平均溫度16.58（表1）。表1從每個柏科植物宿主中分離的內(nèi)生鏈格孢菌株，按照采樣點(diǎn)、植物種類、真菌種類制表 鏈格孢菌產(chǎn)生的抑制/細(xì)胞毒性細(xì)胞內(nèi)外代謝生物活性物質(zhì)。稻瘟病菌常作為抗癌和抗真菌微生物代謝產(chǎn)物初步篩選的抗癌和抗真菌初步篩選的模式菌株。我們目前的研究表明，柏樹內(nèi)生真菌的細(xì)胞外

12、代謝產(chǎn)物比系胞內(nèi)代謝產(chǎn)物的活性更高。因此，從稻瘟病菌分生孢子萌發(fā)和芽管的產(chǎn)生用于評價內(nèi)生菌培養(yǎng)的細(xì)胞內(nèi)外代謝產(chǎn)物的抗增殖和生長抑制活性。數(shù)據(jù)通過表2和表3展示。表2 內(nèi)生鏈格孢菌胞外代謝產(chǎn)物對稻瘟病菌分生病菌的抗增殖活性測定數(shù)值為4-6組數(shù)據(jù)的平均值+，稻瘟病菌分生孢子萌發(fā)被完全抑制；+，稻瘟病菌分生孢子萌發(fā)被抑制為1/3；+，稻瘟病菌分生孢子萌發(fā)被抑制為1/3-2/3大?。?分生孢子大小與對照組相似表3內(nèi)生鏈格孢菌胞內(nèi)代謝產(chǎn)物對稻瘟病菌分生病菌的抗增殖活性測定數(shù)值為4-6組數(shù)據(jù)的平均值+，稻瘟病菌分生孢子萌發(fā)被完全抑制；+，稻瘟病菌分生孢子萌發(fā)被抑制為1/3；+，稻瘟病菌分生孢子萌發(fā)被抑制為

13、1/3-2/3大??；-分生孢子大小與對照組相似結(jié)果發(fā)現(xiàn)，鏈格孢菌的胞外產(chǎn)物對稻瘟病菌孢子萌發(fā)有明顯的抑制作用（表2）。值得注意的是，鏈格孢CSE177 和CSE165(均是從C. sempervirens var. cereiformis)中分離)，在62.5 lg mL-1濃度時均展現(xiàn)了抗增殖活性和在7.8 lg mL-1濃度時展現(xiàn)了抑制芽管伸長的作用。菌株P(guān)OE103和POE182也表現(xiàn)出了在這兩方面很強(qiáng)的活性。同時，如表三所示，鏈格孢菌的細(xì)胞內(nèi)代謝產(chǎn)物對稻瘟病菌的分生孢子起明顯的抑制作用。令人驚訝的是，鏈格孢菌CAE92細(xì)胞內(nèi)外代謝產(chǎn)物（其中胞外產(chǎn)物顯示在所有最小的抗增殖活性）展示出了最

14、高的細(xì)胞毒作用。事實(shí)上，它的胞內(nèi)代謝產(chǎn)物毒性在125 lg mL-1，在31.2 lg mL-1芽管伸長的強(qiáng)抑制作用。鏈格孢菌的抗真菌活性我們通過采用平板對峙的方法，利用稻瘟病菌分生孢子的數(shù)據(jù)來進(jìn)行評估內(nèi)生真菌對模式稻瘟病菌、柏樹植物病原菌D. seriata, Phaeobotryoncupressi和Spencermartinsia viticola的抗真菌活性。事實(shí)上，所有的內(nèi)生真菌分離株在體外菌會有65%-92%的抗菌活性，尤其是對稻瘟病菌（表4）?？偟膩碚f，鏈格孢菌CAE92 和A. pellucida POE182是對所有目標(biāo)菌最有效的菌株。此外，鏈格孢菌 CSE177 和鏈格孢菌

15、CSE165 對所有目標(biāo)菌也有比較明顯的效果。.用培養(yǎng)皿法，A. tangelonis POE103胞外產(chǎn)物的抗真菌活性最高。表4 柏樹內(nèi)生鏈格孢菌對柏樹病原真菌和模式稻瘟病菌的抗菌活性觀測數(shù)據(jù)為3組數(shù)據(jù)（顯著水平P0.05）平均值。相同字母表示差異不顯著。、表5 內(nèi)生鏈格孢菌細(xì)胞內(nèi)外代謝產(chǎn)物的抗菌活性觀測數(shù)據(jù)為3組數(shù)據(jù)（顯著水平P0.05）平均值。a 最小抑菌濃度 b 最小殺菌濃度鏈格孢菌細(xì)胞內(nèi)外代謝產(chǎn)物抑菌和殺菌活性根據(jù)表2表3和表4的數(shù)據(jù)，植物內(nèi)生的 鏈格孢菌 CAE92, A. tangelonis POE103, 和A.pellucida POE182細(xì)胞內(nèi)外代謝產(chǎn)物的分離用來進(jìn)一步

16、研究其對模式芽孢桿菌、離火疫病菌以及丁香假單胞菌的抗菌能力。如圖所示，所有內(nèi)生菌的代謝產(chǎn)物對三株革蘭氏陰性菌和陽性菌均有抑菌和殺菌的活性（表5）。胞外代謝產(chǎn)物的抑菌范圍在7.831.2 lg mL-1，殺菌范圍同樣在7.831.2 lg mL-1。細(xì)胞內(nèi)代謝產(chǎn)物的抑菌范圍在15.662.5 lg mL-1，殺菌范圍在31.2125 lg mL-1。此外，鏈格孢菌CAE92和A. tangelonis POE103對革蘭氏陰性菌更有效，然而A. pellucidaPOE182對革蘭氏陽性菌更有效。討論很明顯所有的高等植物均會寄宿有一個或多個未被開發(fā)出來的內(nèi)生菌。這些微生物主要寄居在植物組織的表皮

17、層之下，而不會引起任何癥狀。內(nèi)生微生物產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物具有獨(dú)特的殺蟲、殺線蟲、抗菌、促進(jìn)植物生長效果，并可以強(qiáng)化寄主植物的環(huán)境耐受能力或者作為觸發(fā)一些現(xiàn)象的信號分子。此外，內(nèi)生菌產(chǎn)生的活性代謝產(chǎn)物是新型生物分子最有可能的來源，其獨(dú)特的遺傳和生物特性可以應(yīng)用在林業(yè)、農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥和生物應(yīng)用等領(lǐng)域。柏科植物成員遍布全球，在林業(yè)、農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥等領(lǐng)域廣泛使用。這類植物包括柏屬、圓柏屬等。其中，柏杉原產(chǎn)于地中海東部。最近的研究顯示，健康的Juniperus virginiana,Cupressus arizonica, 和 T. orientalis樹寄宿有大量的內(nèi)生真菌。同時我們的研究展示了在不同的相近物

18、種中，幾乎有相同數(shù)量的真菌種類。這進(jìn)一步表明，寄主植物和取樣地點(diǎn)影響從柏科植物中分離內(nèi)生真菌區(qū)系的多樣性。此外，我們對從柏科植物體內(nèi)分離的內(nèi)生真菌生物活性的研究，已經(jīng)展示了顯著的抗增殖、抗真菌以及抗細(xì)菌能力。其他人的一些研究也證明從柏科植物內(nèi)生真菌中可以分離出一些抗原制備的物質(zhì)，如紫杉醇和鬼臼毒素等。本文中，我們討論了內(nèi)生鏈格孢屬真菌對柏科植物健康組織的地上部分的影響以及它們的生物活性。如圖所示，分離的八個內(nèi)生真菌分別代表鏈格孢菌以及A. pellucida,、A.tangelonis。這進(jìn)一步證明了子囊菌作為柏科植物內(nèi)生菌的優(yōu)勢。大多數(shù)的菌株（75%）屬于鏈格孢菌。真菌A. pellucid

19、a 和 A. tangelonis僅從法爾斯省的香蒲植物中獲取到。有趣的是，美國報道的斑點(diǎn)落葉病菌也是從香蒲植物中獲得的。在我們的研究中似乎法爾斯港口有比其它地方更多的內(nèi)生真菌。這佐證了我們之前的研究，證明了我們從美國獲得的對內(nèi)生真菌種群生物地理學(xué)研究的準(zhǔn)確性。此外，考慮到之前和現(xiàn)在獲得的結(jié)果，法爾斯省特有的Cupressus sempervirens var. cereiformis展示了內(nèi)生真菌高度顯著生物活性的巨大潛力。這可能展示了伊拉克特有柏科植物和其內(nèi)生真菌之間相互進(jìn)化的關(guān)系。這種關(guān)系可能對宿主柏樹起到保護(hù)作用，如非生物脅迫作用。此外，我們的研究表明柏科植物內(nèi)生菌是一個新型生物源。事

20、實(shí)上，只有從檜柏球植物中分離的鏈格孢菌作為植物病原菌之前被報道過。因此，報道內(nèi)生真菌鏈格孢菌, A. pellucida和 A. tangelonis 之間的聯(lián)系是新穎的。這進(jìn)一步提高了通過探索發(fā)現(xiàn)更多內(nèi)生真菌種類的可能性。這些研究還表明內(nèi)生真菌可以寄居在檜柏球植物中而不引起其其它的病癥。值得注意的是，最近強(qiáng)調(diào)的內(nèi)生真菌(比如從香蒲植物中分離的蘋果斑點(diǎn)落葉病菌)與其它的細(xì)菌有共生關(guān)系，這表明了這些微生物與宿主植物之間復(fù)雜的相互關(guān)系。通常來說，鏈格孢菌是一種嚴(yán)重的植物致病菌與人體條件致病菌。已經(jīng)被用到不同宿主植物中來合成前景良好的生物大分子，如抗癌生物堿：喜樹堿。鏈格孢菌系和A. tangelo

21、nis主要作為植物病原菌。本文我們介紹了內(nèi)生鏈格孢菌株與健康的柏科植物之間的聯(lián)系。此外，我們首次研究了柏科植物內(nèi)生真菌的抗增殖、抗真菌以及抗細(xì)菌能力。我們的數(shù)據(jù)表明，內(nèi)生鏈格孢菌的胞內(nèi)代謝產(chǎn)物與胞外代謝產(chǎn)物相比具有明顯的細(xì)胞毒性。如鏈格孢菌 CAE92，胞外代謝產(chǎn)物具有最低的細(xì)胞毒作用，但胞內(nèi)代謝產(chǎn)物的細(xì)胞毒性最高。這種從檜柏植物中分離的菌株在培養(yǎng)皿對峙試驗中，是對抑制稻瘟病菌、Phaeobotryon cupressi和 Spencermartinsia viticola菌絲生長最有效的真菌，具有92%、88%、87%的抑制作用。所以這些菌株的生物活性受復(fù)雜的因素所影響。而且，鏈格孢菌CSE177和鏈格孢菌CES165產(chǎn)生的細(xì)胞內(nèi)外代謝產(chǎn)物的毒性最強(qiáng)。這兩株菌與對照相比可以抑制目標(biāo)真菌80%-85%的菌絲生長。有趣的是，這兩株菌也是從Cupressus sempervirens var. cereiformis中分離的。我們的抗菌試驗表明，鏈格孢菌能抑制稻瘟病菌、Phaeobotryon cupressi和 Spencermartinsia viticola菌絲生長。在這方面，A. pellucida POE182 、 鏈格孢菌 CAE92, CSE177 和CSE165是最有效的菌株。然而A