絕對定量和相對定量

1、絕對定量和相對定量第1頁，共38頁，2022年，5月20日，19點46分，星期二提綱：實時熒光定量PCR原理 數(shù)學(xué)原理 化學(xué)原理實時熒光定量PCR的方法應(yīng)用 絕對定量 相對定量定量PCR的實驗要素平臺定量PCR儀器介紹第2頁，共38頁，2022年，5月20日，19點46分，星期二實時熒光定量PCR定義： 在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團，利用熒光信號累積實現(xiàn)了實時監(jiān)測整個PCR進程，對起始模板進行定量分析的方法。第3頁，共38頁，2022年，5月20日，19點46分，星期二與普通PCR的區(qū)別普通PCR技術(shù)： 在PCR結(jié)束后對終點產(chǎn)物進行定量分析。實時定量PCR技術(shù)：實時檢測PCR擴增，在擴增的指

2、數(shù)期對起始模板進行定量。第4頁，共38頁，2022年，5月20日，19點46分，星期二第5頁，共38頁，2022年，5月20日，19點46分，星期二第6頁，共38頁，2022年，5月20日，19點46分，星期二第7頁，共38頁，2022年，5月20日，19點46分，星期二熒光閾值是在熒光擴增曲線上人為設(shè)定的一個值，它可以設(shè)定在熒光信號指數(shù)擴增階段任意位置上，一般熒光域值的設(shè)置是 基線（背景）熒光信號的標(biāo)準(zhǔn)偏差的 10 倍。每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達設(shè)定的域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)被稱為 CT 值（ threshold value ）。 第8頁，共38頁，2022年，5月20日，19點46分，星期二第

3、9頁，共38頁，2022年，5月20日，19點46分，星期二定量PCR的數(shù)學(xué)原理第10頁，共38頁，2022年，5月20日，19點46分，星期二第11頁，共38頁，2022年，5月20日，19點46分，星期二斜率與擴增效率第12頁，共38頁，2022年，5月20日，19點46分，星期二第13頁，共38頁，2022年，5月20日，19點46分，星期二熒光定量PCR化學(xué)原理 非特異性熒光標(biāo)記： 1、SYBR Green 特異性熒光標(biāo)記： 2、TaqMan第14頁，共38頁，2022年，5月20日，19點46分，星期二1、SYBR Green 法第15頁，共38頁，2022年，5月20日，19點46

4、分，星期二SYBR Green 熔解曲線分析第16頁，共38頁，2022年，5月20日，19點46分，星期二SYBR Green法優(yōu)缺點優(yōu)點:對DNA模板沒有選擇性適用于任何DNA使用方便-不必設(shè)計復(fù)雜探針非常靈敏便宜第17頁，共38頁，2022年，5月20日，19點46分，星期二2、TaqMan探針法第18頁，共38頁，2022年，5月20日，19點46分，星期二TaqMan作用機理第19頁，共38頁，2022年，5月20日，19點46分，星期二TaqMan法優(yōu)缺點第20頁，共38頁，2022年，5月20日，19點46分，星期二 Real-time PCR 方法應(yīng)用第21頁，共38頁，202

5、2年，5月20日，19點46分，星期二絕對定量(Absolute Quantification，AQ) 病原體檢測 轉(zhuǎn)基因食品檢測 基因表達研究相對定量(Relative Quantification，RQ) 基因在不同組織中的表達差異 藥物療效考核 耐藥性研究第22頁，共38頁，2022年，5月20日，19點46分，星期二絕對定量與相對定量的定義第23頁，共38頁，2022年，5月20日，19點46分，星期二絕對定量通過標(biāo)準(zhǔn)品定量絕對定量的標(biāo)準(zhǔn)樣品： 已知拷貝數(shù)的質(zhì)粒DNA，做系列稀釋。標(biāo)準(zhǔn)樣品的種類：含有和待測樣品相同擴增片段的克隆質(zhì)粒含有和待測樣品相同擴增片段的cDNAPCR的產(chǎn)物第24

6、頁，共38頁，2022年，5月20日，19點46分，星期二絕對定量：從熒光到拷貝數(shù)第25頁，共38頁，2022年，5月20日，19點46分，星期二相對定量通過內(nèi)標(biāo)定量內(nèi)標(biāo)（Endogenous Control）通常是-actin、GAPDH基因等看家基因在細胞中的表達量或在基因組中的拷貝數(shù)恒定，受環(huán)境因素影響小內(nèi)標(biāo)定量結(jié)果代表了樣本中所含細胞或基因組數(shù)量第26頁，共38頁，2022年，5月20日，19點46分，星期二相對定量：參照因子Calibrator 第27頁，共38頁，2022年，5月20日，19點46分，星期二相對定量分析方法1 -Ct前提：目標(biāo)序列和內(nèi)參序列的擴增效率接近100且偏

7、差在 5以內(nèi) 1、用內(nèi)參基因的CT值歸一目標(biāo)基因的CT值： CT（test)= CT （target,test) - CT （ref,test) CT（calibrator)= CT （target, calibrator) - CT （ref, calibrator) 2、用校準(zhǔn)樣本的CT值歸一試驗樣本的CT值： CT= CT（test) - CT（calibrator) 3、計算表達水平比率： 2 CT=表達量的比值第28頁，共38頁，2022年，5月20日，19點46分，星期二相對定量分析方法2：雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法目標(biāo)基因與內(nèi)參基因擴增效率不同 待測樣品目的基因濃度 待測樣品內(nèi)參基因濃度 F=

8、 對照樣品目的基因濃度 對照樣品內(nèi)參基因濃度第29頁，共38頁，2022年，5月20日，19點46分，星期二 定量PCR的實驗要素第30頁，共38頁，2022年，5月20日，19點46分，星期二樣品DNA純度：OD260/OD280=1.8，1.6 2.0之間DNA用量：0.05 ng 100 ngRNA純度：OD260/OD280=2.0 cDNA用量：1-100 ng 總RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA取1 uL第31頁，共38頁，2022年，5月20日，19點46分，星期二標(biāo)準(zhǔn)品第32頁，共38頁，2022年，5月20日，19點46分，星期二標(biāo)準(zhǔn)品梯度稀釋方法第33頁，共38頁，2022年，5月20日，19點46分，星期二復(fù)管測試樣品和標(biāo)準(zhǔn)品都要重復(fù)重復(fù)次數(shù)須遵循統(tǒng)計學(xué)要求第34頁，共38頁，2022年，5月20日，19點46分，星期二平臺PCR儀介紹ABI 7500 fast第35頁，共38頁，2022年，5月20日，19點46分，星