結(jié)冷膠發(fā)酵條件的優(yōu)化

1、結(jié)冷膠發(fā)酵條件的優(yōu)化第1頁，共24頁，2022年，5月20日，18點51分，星期二框架研究背景課題方向124第2頁，共24頁，2022年，5月20日，18點51分，星期二研究背景結(jié)冷膠是近年來所發(fā)現(xiàn)的最有 發(fā)展前景的微生物多糖之一，過去曾稱雜多糖PS-60，1987年，由美國科學家Kaneko and Kang在 默克公司Kelco分公司 實驗室發(fā)現(xiàn)了結(jié)冷膠，后來該公司利用稍動鞘脂假單胞菌為生產(chǎn)菌，將其正式投入生產(chǎn)。 結(jié)冷膠是一種高分子陰離子型多糖，主鏈是線性四糖重復單位，包括-D-葡萄糖，-D-葡萄糖醛酸， -(1-4)-L-鼠李糖，其組成比例大約為2:1:1，分子量高達500KD，有一些基

2、團被乙酰基和L-甘油酸酯（或鹽）取代。第3頁，共24頁，2022年，5月20日，18點51分，星期二研究背景結(jié) 冷 膠 以 兩 種 形 式 存 在，天然 結(jié)冷膠和低酰 基結(jié)冷膠第4頁，共24頁，2022年，5月20日，18點51分，星期二研究背景結(jié)冷膠生物合成的可能途徑 圖中PGI：磷酸葡萄糖異構酶，PGM：磷酸葡萄糖變位酶，UGP：UDP-葡萄糖焦磷酸化酶，TGP：TDP-葡萄糖焦磷酸化酶，UGD：UDP-葡萄糖脫氫酶，TRS：TDP-鼠李糖合成酶第5頁，共24頁，2022年，5月20日，18點51分，星期二研究背景結(jié)冷膠的特性1.極好的穩(wěn)定性。結(jié)冷膠形成的凝膠具有極好的熱穩(wěn)定性，而且還能耐

3、酸堿。結(jié)冷膠可以替代瓊脂作為微生物培養(yǎng)基的膠凝劑。2.獨特的澄清透明性3.良好的配伍性第6頁，共24頁，2022年，5月20日，18點51分，星期二結(jié)冷膠應用1 面制品中的應用.可以改善面條的口 感，還可以提 高它 們的粘 度，彈 性以及硬度2 乳制品中的應用.具有極其良好的增 稠性和凝膠性3代替瓊脂。對于對培養(yǎng)基澄清度要求非常高的嗜溫微生物而言，高純度結(jié)冷膠代替 瓊 脂，可以解 決這個問題。第7頁，共24頁，2022年，5月20日，18點51分，星期二課題方向1.從 實驗保 藏的菌種 出發(fā)，通過紫外線（UV）誘 變和亞硝 基胍（NTG）誘變，篩選得 到高產(chǎn)結(jié)冷膠的菌 株；2.通過單因素實驗和

4、響應面實驗對菌株發(fā)酵 產(chǎn)結(jié)冷膠的 培養(yǎng)基成分和最適培養(yǎng)條 件進 行優(yōu)化，確定了菌株的最佳 的發(fā)酵條件。并通過10L、1噸發(fā)酵罐的實驗，進一步摸索菌株的 特性，從 而 使其產(chǎn)量 提高；3.研究了離子對結(jié) 冷膠凝膠溫度 及凝膠強度 的 影響，可為 后提取 提供一定的 理論 參數(shù)。4.對結(jié) 冷膠的 后提取進 行了初 步的 摸索。第8頁，共24頁，2022年，5月20日，18點51分，星期二1.結(jié)冷膠菌種的誘變本實驗室 保藏了 一株生產(chǎn)結(jié) 冷膠的菌株Pseudomonas elodea（伊樂假單胞菌），但 該菌 株產(chǎn)結(jié)冷 膠的 量較低，僅有 3.9g/L左 右，不適合 工業(yè)化 生產(chǎn)。在研 究過 程中，

5、以實驗室原有 菌株為出 發(fā)菌株 進行了 紫外線（UV）、亞硝 基胍（NTG）誘變處理，經(jīng)過 大量 的自然分 離，獲得了一 株轉(zhuǎn)化 率較高的 菌株P-8， 經(jīng) 發(fā)酵試驗檢測，其產(chǎn) 膠得率 達到14.2g/L，是初 始菌 株產(chǎn) 膠率的3.64倍。 第9頁，共24頁，2022年，5月20日，18點51分，星期二1.結(jié)冷膠菌種的誘變菌株及菌落形態(tài)特征第10頁，共24頁，2022年，5月20日，18點51分，星期二1.結(jié)冷膠菌種的誘變第11頁，共24頁，2022年，5月20日，18點51分，星期二1.結(jié)冷膠菌種的誘變（小結(jié)）以實驗室原有菌株為出發(fā)菌株，進行了紫外線（UV）、亞硝基胍（NTG）誘變處理，得

6、到一株產(chǎn)膠率高并且性能穩(wěn)定的菌株P-8，使結(jié)冷膠的產(chǎn)膠得率由3.9g/L提高到14.2g/L，提高了2.64倍。并且，該菌株碳源利用較廣，能很好的利用有機氮源，最適生長溫度為28-30，最適生長初始pH為6.57.0，用磷酸鹽緩沖液可保藏半年時間。第12頁，共24頁，2022年，5月20日，18點51分，星期二2.結(jié)冷膠發(fā)酵條件的研究菌株的高產(chǎn)特性不僅由其遺傳特性決定，而且也由其所處的環(huán)境條件決定。 先在搖瓶培養(yǎng)的基礎上，確定了較適宜的發(fā)酵培養(yǎng)基組成和最佳的培養(yǎng)條件。然后在搖瓶的基礎上，在發(fā)酵罐中進一步優(yōu)化伊樂假單胞菌生產(chǎn)結(jié)冷膠的條件。從而實現(xiàn)結(jié)冷膠高產(chǎn)量和高生產(chǎn)強度的相對統(tǒng)一。 第13頁，共

7、24頁，2022年，5月20日，18點51分，星期二2.結(jié)冷膠發(fā)酵條件的研究1 種齡及接種量對結(jié)冷膠發(fā)酵的影響2 初始pH對發(fā)酵的影響3 溫度對發(fā)酵的影響4 培養(yǎng)基裝液量及搖床轉(zhuǎn)速對發(fā)酵的影響第14頁，共24頁，2022年，5月20日，18點51分，星期二2.結(jié)冷膠發(fā)酵條件的研究1 種齡及接種量對結(jié)冷膠發(fā)酵的影響 種子的活力主要由種子液的種齡決定，菌體生長最旺盛階段為對數(shù)生長期，選擇對數(shù)生長中后期的種子作為種子液為最佳。本菌株對數(shù)生長中后期的種子液從外觀來看有一定的粘稠性，鏡檢菌體形態(tài)均一，粗壯，染色均勻。第15頁，共24頁，2022年，5月20日，18點51分，星期二結(jié)冷膠發(fā)酵條件的研究本實

8、驗中將不同種齡（16-32hr）的種子培養(yǎng)液皆以相同的接種量（10%）分別接入搖瓶震蕩培養(yǎng)（培養(yǎng)時間為72h），結(jié)果如圖3-9所示。由此可見，種子液最佳種齡為24h，種齡過長或過短，發(fā)酵液的得率偏低。因此選用24h作為最佳接種時間。第16頁，共24頁，2022年，5月20日，18點51分，星期二2.結(jié)冷膠發(fā)酵條件的研究2初始pH對發(fā)酵的影響發(fā)酵過程中底物的消耗速率、細胞生長速率與接種量的大小有密切的關系，尤其是延遲期的長短與接種量關系極其密切，因此這也間接影響了發(fā)酵周期的長短和目的產(chǎn)物的產(chǎn)量。接種量過少會導致菌體延滯期延長，從而延長整個發(fā)酵周期。而過多的接種量會導致菌體的過快生長，消耗了大量的

9、底物，從而影響了目的產(chǎn)物的合成，同時也會增加種子液成本第17頁，共24頁，2022年，5月20日，18點51分，星期二2.結(jié)冷膠發(fā)酵條件的研究 由圖3-10可以看出，選取接種量為3%-10%時，結(jié)冷膠的得率變化不大，且達到結(jié)冷膠的最高得率，接種量小于5%時，發(fā)酵周期延長，接種量大于5%時，發(fā)酵周期為72h左右，發(fā)酵周期較短。因此，選擇最佳接種量為5%。第18頁，共24頁，2022年，5月20日，18點51分，星期二由圖3-10可以看出，選取接種量為3%-10%時，結(jié)冷膠的得率變化不大，且達到結(jié)冷膠的最高得率，接種量小于5%時，發(fā)酵周期延長，接種量大于5%時，發(fā)酵周期為72h左右，發(fā)酵周期較短。

10、因此，選擇最佳接種量為5%。結(jié)冷膠發(fā)酵條件的研究第19頁，共24頁，2022年，5月20日，18點51分，星期二2.結(jié)冷膠發(fā)酵條件的研究3 溫度對發(fā)酵的影響不同種類的微生物對pH的要求不同，因此發(fā)酵液初始pH對微生物的生長和代謝產(chǎn)物的形成都有很大的影響，即使是同一種微生物，環(huán)境pH不同，產(chǎn)物積累量也不同。 第20頁，共24頁，2022年，5月20日，18點51分，星期二結(jié)冷膠發(fā)酵條件的研究培養(yǎng)基的初始pH對胞外多糖的產(chǎn)量影響較大，選擇不同起始pH，進行發(fā)酵實驗，結(jié)果如圖3-11所示，發(fā)酵液初始pH對結(jié)冷膠得率的影響明顯，當PH為7.0時，結(jié)冷膠的得率達到最高。第21頁，共24頁，2022年，5月20日，18點51分，星期二2.結(jié)冷膠發(fā)酵條件的研究4 培養(yǎng)基裝液量及搖床轉(zhuǎn)速對發(fā)酵的影響溫度對微生物菌體的生長代謝、產(chǎn)物合成等影響是多方面的，其中最重要的影響是可以改變細胞代謝過程中各種關鍵酶的活性。第22頁，共24頁，2022年，5月20日，18點51分，星期二結(jié)冷膠