實驗一紙層析法分離鑒定氨基酸

1、關于實驗一紙層析法分離鑒定氨基酸181第1頁，共18頁，2022年，5月20日，22點8分，星期三182 【二、實驗原理】 層析技術 是利用混合物中各組分的物理化學性質的差別，使各組分以不同程度分布在兩相中，其中一相為固定相，另一相流過此相稱作流動相，并使各組分以不同速度移動，從而達到分離的目的。 可分離物質 糖類、有機酸、氨基酸、核苷等第2頁，共18頁，2022年，5月20日，22點8分，星期三183固定相 在層析中起分離作用而不隨層析過程移動的物質。如紙層析中固定相是濾紙纖維中結合的水。固定相被看成是樣品移動的阻力。流動相 在層析過程因其本身流動而推動樣品移動的物質。第3頁，共18頁，20

2、22年，5月20日，22點8分，星期三184名稱操作方式固定相流動相分離依據(jù) 分配層析 紙層析 薄層層析液體液體 溶解度 離子交換層析 離子交換柱層析固體液體 帶電性 靜電引力 吸附層析 吸附薄層層析 氣體吸附層析固體液體氣體 吸附力 親和層析 酶與底物 抗原與抗體固體液體 配體專一性 凝膠層析 凝膠過濾固體液體 分子大小層析的分類第4頁，共18頁，2022年，5月20日，22點8分，星期三185 分配層析：是利用不同物質在兩種不相溶的溶劑中的分配系數(shù)不同而達到分離的一種技術。分配系數(shù) =溶質在固定相的溶解度溶質在流動相的溶解度第5頁，共18頁，2022年，5月20日，22點8分，星期三186

3、 紙層析是以濾紙作為惰性支持物的分配層析：紙纖維上的 OH 基具有親水性，所以能吸附一層水作為固定相，而通常把有機溶劑作為流動相。流動相流經(jīng)支持物時與固定相間連續(xù)抽提，使物質在兩相間不斷地分配而得到分離。第6頁，共18頁，2022年，5月20日，22點8分，星期三187 溶質在濾紙上的移動速率用f（比移）值來表示： 展層層斑點中心與原點間的距離 Rf = - 溶劑前沿與原點之間的距離第7頁，共18頁，2022年，5月20日，22點8分，星期三188第8頁，共18頁，2022年，5月20日，22點8分，星期三189 影響Rf值的因素（多種） 物質結構與極性 物質的極性大小決定了物質在水 和有機溶

4、劑之間的分配情況。pH值 展層劑的pH影響被分離物質的極性基團的解離形式。 層析濾紙的質量 層析用濾紙要質地均勻，緊密， 有一定的機械強度，并含雜質少。國產新華濾紙可 用于一般的紙層析。第9頁，共18頁，2022年，5月20日，22點8分，星期三1810 【三、器材與試劑】 器材： 1、層析缸 2、毛細管 3、噴霧器 4、培養(yǎng)皿 5、層析濾紙(新華一號) 試劑： 1、擴展劑 （正丁醇：水：冰醋酸= 4：3：1） 2、顯色劑 0.1茚三酮正丁醇溶液。 3、氨基酸溶液 0.5的賴氨酸、脯氨酸、纈氨酸、亮氨酸溶液 及它們的混合液 第10頁，共18頁，2022年，5月20日，22點8分，星期三1811

5、 1、層析濾紙準備：取層析濾紙(長20 cm、寬15 cm)一張。在紙的一端距邊緣23 cm處用鉛筆劃一條直線，在此直線上每間隔2cm作一記號。 2、點樣：用毛細管將各氨基酸樣品分別點在這5個位置上，干后再點一次。每點在紙上擴散的直徑，最大不超過3 mm。【四、實驗步驟】第11頁，共18頁，2022年，5月20日，22點8分，星期三1812 3、擴展 ：用線將濾紙縫成筒狀，紙的兩邊不能接觸。將濾紙直立于培養(yǎng)皿中（點樣的一端在下，擴展劑的液面需低于點樣線1 cm）。待溶劑上升約15 cm時即取出濾紙，鉛筆描出溶劑前沿界線，自然干燥或用吹風機熱風吹干。 4、顯色： 用噴霧器均勻噴上0。1茚三酮正丁

6、醇溶液，然后置烘箱中烘烤5分鐘(100)或用熱風吹干即可顯出各層析斑點。 5、計算Rf值第12頁，共18頁，2022年，5月20日，22點8分，星期三1813【五、實驗結果與分析】【六、注意事項】【七、思考題】1、實驗中作為固定相和流動相的物質分別是什么？2、Rf值的含義、影響因素？ 下次實驗 ：實驗二 蛋白質和氨基酸的顏色反應值 日 生 值 日第13頁，共18頁，2022年，5月20日，22點8分，星期三1814小實驗當濾紙接觸到溶劑時，溶液將上升。濾紙上的小圓點是4種不同的氨基酸的混合物。看看接下來會發(fā)生什么事情第14頁，共18頁，2022年，5月20日，22點8分，星期三1815可以看出1號氨基酸上升的最高，在濾紙上跑得最快。而4號氨基酸與濾紙的結合最緊，因此跑的速度比其他的氨基酸慢。1234第15頁，共18頁，2022年，5月20日，22點8分，星期三1816這就是紙色譜法。對照上圖，可知道1-4號的各代表什么氨基酸。紙色譜法是分離鑒定蛋白質的氨基酸組成的重要工具。 1234甘氨酸半胱氨酸組氨酸纈氨酸第16頁，共18頁，