亞硝化菌的種類,生長特性,亞硝化過程與機(jī)理

1、亞硝化菌的種類，生長特性，亞硝化過程與機(jī)理摘要：從亞硝化細(xì)菌的生長特性出發(fā)，主要介紹了亞硝化細(xì)菌的種類，包括亞硝化單胞 菌屬、亞硝化球菌屬、亞硝化螺菌屬、亞硝化葉菌屬、亞硝化弧菌屬，并探討了亞硝化過程 中的氧化和生化機(jī)理。關(guān)鍵詞：亞硝化菌，亞硝化作用，機(jī)理亞硝化細(xì)菌生長特性 亞硝化細(xì)菌又叫氨氧化細(xì)菌，有自養(yǎng)型與異氧型之分，一般認(rèn)為自養(yǎng)型氨氧化細(xì)菌是硝 化作用的主要菌群。所有自養(yǎng)型氨氧化細(xì)菌，都是革蘭氏陰性細(xì)菌，自養(yǎng)生長時，以氨為唯 一能源，以CO2為唯一碳源；混合營養(yǎng)生長時，可同化有機(jī)物質(zhì)。亞硝酸細(xì)菌的生長極為緩 慢。在適宜的條件下需 24h 才能完成一次分裂周期。在進(jìn)行固體培養(yǎng)的過程中一般需

2、數(shù)月 才能見到菌落生長1。亞硝酸細(xì)菌喜歡微偏堿性的環(huán)境，適合大多數(shù)氨氧化細(xì)菌生長的條件 為：溫度25-30C, pH，氨濃度2-10mmol/L。倍增時間8小時至數(shù)天。在純培養(yǎng)中，培養(yǎng) 基中若加入有機(jī)物質(zhì)如酵母提取物等將會抑制亞硝酸細(xì)菌的生長，因此在進(jìn)行亞硝酸細(xì)菌的 分離培養(yǎng)時所培養(yǎng)分離的細(xì)菌的純度可利用在培養(yǎng)基中加入（酵母粉、牛肉膏、蛋白胨等）有 機(jī)物的方法進(jìn)行檢測2。但是自然環(huán)境中有機(jī)物質(zhì)對亞硝酸細(xì)菌的影響不如在純培養(yǎng)中的大 大亞硝酸細(xì)菌對污水組成、pH和溫度等的改變都敏感3。亞硝酸細(xì)菌的分類 亞硝酸細(xì)菌的分類主要根據(jù)細(xì)菌形態(tài)的表型特征、細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞質(zhì)膜的分布及它們 16SRNA 序列的同源

3、性。 1984-1989 年的伯杰氏細(xì)菌系統(tǒng)分類學(xué)把硝化細(xì)菌分為九個屬： 硝化桿菌屬、硝化刺菌屬、硝化球菌屬、硝化螺菌屬、亞硝化單胞菌屬、亞硝化螺菌屬、亞 硝化球菌屬、亞硝化葉菌屬和亞硝化弧菌屬等。而目前則傾向于把亞硝酸細(xì)菌分為兩個單一 細(xì)胞起源的群體，它們分別屬于變形菌綱的B亞綱和Y亞綱。在對這兩個亞綱的亞硝酸細(xì)菌作 進(jìn)一步的分類時，不同的學(xué)者還有些細(xì)微的差別。 Votek 等認(rèn)為除了海洋亞硝酸球菌屬于變 形菌Y亞綱外，其它的亞硝酸細(xì)菌即亞硝酸單抱菌和亞硝酸螺旋菌兩個種群屬于變形菌B亞 綱。其中亞硝酸單孢菌包括歐洲亞硝酸單孢菌和亞硝酸運(yùn)動球菌，亞硝酸螺旋菌包括亞硝酸 螺旋菌屬、亞硝酸顫菌屬和

4、亞硝酸葉菌屬2。這種分類方法可用圖1表示。Philips等認(rèn)為海洋亞硝化球菌和N. halophilus屬于變形菌Y亞綱，其它的亞硝酸細(xì)菌屬 于變形菌B亞綱，包括亞硝化單抱菌屬和亞硝化螺旋菌屬。Juretschko同樣認(rèn)為海洋亞硝化球菌和 屬于變形菌Y亞綱，但是他認(rèn)為于變形菌B亞 綱亞硝酸細(xì)菌應(yīng)包括四個屬，即亞硝化單胞菌屬、亞硝化螺菌屬、亞硝化葉菌屬和亞硝化弧 菌屬，而且后三個屬彼此關(guān)系密切5。除了亞硝化單胞菌屬(Nitrosomonas)外，其它能把氨氧化成亞硝酸的細(xì)菌屬包括亞硝化 螺菌屬(Nitrosospira)、亞硝化球菌屬(Nitrosococcus)、亞硝化 弧菌屬(Nitroso

5、vibrio)、 亞硝化葉菌屬(Nitrosolobus)、亞硝化膠團(tuán)菌屬(Nitrosogloea)、亞硝化囊菌屬(Nitrosocystis)。 土壤生境中常見的是亞硝化單胞菌屬、亞硝化球菌屬、亞硝化葉菌屬、亞硝化螺菌屬。海洋 生境中常見的是亞硝化單胞菌屬、亞硝化球菌屬、亞硝化螺菌屬。鹽湖生境中則有亞硝化單 胞菌屬6。亞硝化單胞菌屬(Nitrosomonas) 在亞硝化單胞菌屬中，是最早被分離并描述的種。除此以外，已確定的種還有8 個，隨 著研究的深入，新種還會繼續(xù)增加。亞硝化單胞菌屬菌株呈桿狀或橢球狀。菌體單生，很少成鏈。菌體游離或包埋在黏液內(nèi)。細(xì)胞有內(nèi)膜，呈扁平泡囊，分布于四周。革蘭氏

6、染色陰性，好氧生長。生長溫度范圍5-30C， 最適生長溫度30C左右。生長pH值范圍最適生長Ph值范圍。能量(主要指ATP)和還原力主 要指nad(p)h2來源于氨的氧化。許多菌株產(chǎn)生脲酶，能夠利用尿素。以CO2為碳源，進(jìn)行 自養(yǎng)生長；細(xì)胞擁有羧酶體(carboxysome)，內(nèi)含Calvin循環(huán)中固定CO2的關(guān)鍵酶二磷酸 核酮糖羧化酶。也能以CO2或有機(jī)物作為碳源，進(jìn)行混養(yǎng)(混合營養(yǎng))生長，但不能以有機(jī) 物作為碳源，進(jìn)行異氧生長。細(xì)胞產(chǎn)生豐富的細(xì)胞色素，使細(xì)胞懸液呈黃色或紅色。強(qiáng)光照 和高氧分壓可抑制生長。亞硝化球菌屬(Nitrosococcus)Nitrosococcus 包含、和三個種。

7、菌體呈球狀至橢球狀，可以是單球菌、雙球菌和四聯(lián)球 菌，常包埋于黏液內(nèi)而形成菌膠團(tuán)。細(xì)胞有內(nèi)膜，呈扁平泡囊，分布于四周或堆積于中央。 革蘭氏染色陰性。依靠叢生鞭毛或單生鞭毛運(yùn)動。好氧生長。生長溫度范圍5-30C，最適生 長溫度30C左右。生長pH范圍，最適生長Ph范圍。能量和還原力來源于氨的氧化。一些 菌株產(chǎn)生脲酶，能夠利用尿素，能自養(yǎng)生長，也能混養(yǎng)生長，但不能異樣生長。細(xì)胞內(nèi)含有 豐富的細(xì)胞色素，使細(xì)胞懸液呈黃色或紅色。亞硝化螺菌屬(Nitrosospira)Nitrosospira 只有一個種。菌體呈螺旋狀，有 3-20 圈。細(xì)胞沒有內(nèi)膜，也沒有羧酶體。 革蘭氏染色陰性。好氧生長。生長溫度范

8、圍20-35C。生長pH范圍。能量和還原力來源于 氨的氧化。嚴(yán)格自養(yǎng)生長。細(xì)胞內(nèi)含細(xì)胞色素，但不含其他色素。亞硝化葉菌屬(Nitrosolobus)Nitrosolobus 只有一個種。菌體形態(tài)多樣，裂片形細(xì)胞被內(nèi)陷的細(xì)胞膜分隔，每個細(xì)胞 有 1-4 個中心小室，其外面有 5-20 個膜結(jié)合的小室環(huán)繞。以縊縮的方式分裂。革蘭氏染色 陰性。好氧生長。能量和還原力來源于氨的氧化。主要自養(yǎng)生長，也能混養(yǎng)生長，但不能異 樣生長。最適生長溫度25-30C。最適生長pH。亞硝化弧菌屬(Nitrosmdbrio)Nitrosmdbrio 只有一個種。菌體細(xì)長弧狀，細(xì)胞沒有內(nèi)膜，羧酶體不明顯。革蘭氏染色 陰性

9、。嚴(yán)格好氧生長。最適生長 Ph 范圍。能量和還原力來源于氨的氧化。主要自養(yǎng)生長， 也能混養(yǎng)生長，但不能異樣生長。表 1 各種氨氧化細(xì)菌的特征特征亞硝化單胞菌屬(Nitrosomonas)亞硝化球菌屬(Nitrosococcus)亞硝化螺菌屬(Nitrosospira)亞硝化葉菌屬(Nitrosolobus)亞硝化弧菌屬(Nitrosmdbrio)形態(tài)桿狀至橢球狀球狀至橢球狀緊密螺旋狀多形狀細(xì)長弧狀鞭毛極生至偏極生叢生或單生周生周生極生至偏極生細(xì)胞內(nèi)膜 排列方式呈扁平泡囊，分 布于四周呈泡囊分布于四 周或堆積于中央無內(nèi)膜使細(xì)胞分隔無內(nèi)膜菌體大小時代時間/h8-1224化能無機(jī)營養(yǎng)化能無機(jī)營養(yǎng)化能

10、無機(jī)營養(yǎng)化能無機(jī)營養(yǎng)化能無機(jī)營養(yǎng)儲存物多聚磷酸肝糖，多聚磷酸肝糖，多聚磷酸細(xì)胞色 素，色素淡黃至淡紅淡黃至淡紅淡黃至淡紅淡黃至淡紅pH值范圍溫度范圍/C5-30(25-30)12-3015-30(20-35)115-3025-30 -521:為最適溫度范圍；2:為最低溫度范圍。亞硝化反應(yīng)過程與機(jī)理亞硝化作用則是硝化作用從 NH4+ 或 NH3 到 NO2- 的反應(yīng)過程，是氮素循環(huán)的重要環(huán) 節(jié)，由氨氧化細(xì)菌(NH3-oxidizers,又被稱為初級硝化細(xì)菌primary nitrifiers)、亞硝化細(xì)菌 (ammonia-oxidizingbacteria )來完成。生化氧化8：NH4+ +

11、+ 2HCO3-亞硝酸菌 O2- + 2H2CO3 + (240-350kJ/mol)(1)生化合成：13NH4+ + 23HCO3- 亞硝酸菌.10NO2- + 8H2CO3 + 3C5H7NO2 + 19H20 (2)則第一階段的總反應(yīng)式(包括氧化和合成)為：55NH4+ + 76O2+109HCO3亞硝酸菌 C5H7NO2 + 54NO2- +104H2CO3 + +57H20 (3)氨氧化細(xì)菌是一類化能自養(yǎng)型細(xì)菌，氨是其進(jìn)行自養(yǎng)生長的唯一能源。從熱力學(xué)觀點(diǎn)來看，亞硝化細(xì)菌利用的基質(zhì)為低級能源。相對于呼吸鏈上的電子載體而言，氨氧化的氧化還 原電位值E；(NO2- / NH4+)= 340

12、 mV，氧化磷酸化效率很低，所能產(chǎn)生的ATP非常有限。亞硝化細(xì)菌中不存在基質(zhì)水平磷酸化，它們依靠氧化磷酸化來貯存能量。在25 C, pH 7的條件下，NH3氧化為NO2-的吉布斯自由能為kJ(mol N)-1，即使全部轉(zhuǎn)化為ATP，最 多僅產(chǎn)生mol ATP-(mol NH4+)-i。NH3氧化所釋放的電子只能傳遞給呼吸鏈上較低端的物質(zhì)， 因此 NH3 的氧化反應(yīng)不可能直接耦聯(lián)到呼吸鏈上第一個成分煙酰胺腺嘌呤二核苷酸 ( nicotine amide dinucleotide,NAD )的還原反應(yīng)，能量不得不用于使電子躍遷到這一較高能級， 即用于所謂的逆電子流過程中。這些因素使得亞硝化細(xì)菌生長

13、很緩慢，世代期為836 h， 經(jīng)過710 d的培養(yǎng)菌落很微小，大多直徑在100ym左右。利用相同數(shù)量的能量，亞硝化 單胞菌所產(chǎn)生的細(xì)胞物質(zhì)僅為異養(yǎng)菌的1 %4 %，這是因?yàn)樾枰腁TP和還原力來還原 CO26。但從生化水平上看，硝化作用遠(yuǎn)非如此簡單，它涉及多種酶催化的代謝途徑，并伴隨著 復(fù)雜的物質(zhì)和能量轉(zhuǎn)化。在亞硝化細(xì)菌的作用下, 氨轉(zhuǎn)變?yōu)閬喯跛岬难趸^程中, 氮原子價從-3變至+3, 電子的 移動達(dá)6個, 故必然會有中間產(chǎn)物, 但中間產(chǎn)物究竟有幾個, 現(xiàn)仍不大清楚現(xiàn)已證明, 其中一種中間體是羥胺（nh2oh）,認(rèn)為由羥胺進(jìn)一步氧化成亞硝酸必需經(jīng)過兩個階段 即羥胺 脫氫形成像硝酰（NOH）那

14、樣的氧化態(tài)中間體，然后在酶的作用下由硝酰轉(zhuǎn)變成亞硝酸。而亞 硝酸在硝化細(xì)菌的作用下可直接氧化成NO3-9。亞硝化作用涉及多種酶催化的代謝途徑，即 為：NH3 氨單加氧酶NH2OH 羥胺氧還酶 NO 羥胺氧還酶N02-。氨氧化為羥胺的生化反應(yīng)可表示為7 ：4）（ 5 ）NH3 + 2OH 4）（ 5 ）+2H+ +2e-HO G = -137 kJ/ molNH3 + O2+ 2H氨單加氧酶 H2OH + H2O G = -120kJ/ mol （6）根據(jù)化學(xué)反應(yīng)的自由能變化判斷，在標(biāo)準(zhǔn)狀態(tài)下，氨的羥化反應(yīng)不易進(jìn)行（4）式；需 要氧的還原反應(yīng)（5）式來拉動。只有當(dāng)兩個反應(yīng)耦合時（6）式氨的氧化才

15、能順利進(jìn)行。羥胺氧化成亞硝酸鹽被認(rèn)為是一個分兩步進(jìn)行的反應(yīng)，中間產(chǎn)物可能是與酶結(jié)合的HNO,也可能是NO。羥胺氧化為亞硝酸鹽的生化反應(yīng)可表示為:NH2OH + 5H2O HNO2 + 4H+ +4e- G =+23 kJ/ mol+ 2H+ + 2e-H2O G =-137 kJ/ molNH2OH + 羥月HNO 2 + 2H+ + 2e- G =-114 kJ/ mol首先在氨單加氧酶（AMO）的催化下將氨氧化成羥氨，再經(jīng)羥氨氧化還原酶（HAO）的催 化下將羥氨氧化成亞硝酸，進(jìn)而由硝化細(xì)菌的亞硝酸鹽氧化還原酶催化形成硝酸10。H汕弋啓Termini! oxidnseand NAD*UQm5

16、52 木4e圖 2 亞硝化菌的氨氧化機(jī)制參考文獻(xiàn)Nejidat A ,et al. Isolation and characterization of a functional promoter from Nitrosrmonas europaea J . FEMS Microbiol Lett, 1996,137 :912.Homes N G,et al. Mutagenesis and expression of amo ,which codes for ammonia monooxygenase in Ntrosomonas europaeaJ . J Bacteriol ,1998 ,

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