組織裂解液和細(xì)胞裂解液的配制

1、組織裂解液和細(xì)胞裂解液如何配制?一、細(xì)胞裂解液配制方法一一、試劑準(zhǔn)備1、新鮮配制冷的RIPA裂解緩沖液：150 mM NaCL1% NP-40 （去垢劑）0.1% SDS （去垢劑）2ug/ml Aprotinin （蛋白酶抑制劑）（使用前加入）2ug/ml Leupeptin （蛋白酶抑制劑）（使用前加入）1 mM PMSF （蛋白酶抑制劑）1.5 mM EDTA （蛋白酶抑制劑）1mM NaVanadate （磷酸脂酶抑制劑）（任選）以上所有試劑均按比例溶于150 mM NaCL溶液中。2、冷的PBS中加入1 mM PMSF1.5 mM EDTA1mM NaVanadate （釩酸鈉）（任

2、選）3、對數(shù)期生長狀態(tài)佳的細(xì)胞，75cm至少3-4瓶（90%以上生長面積）。二、實(shí)驗(yàn)步驟1、將長滿細(xì)胞的培養(yǎng)瓶放置在冰上，用吸液管吸出培養(yǎng)液。加入足夠的冷的PBS在培養(yǎng) 瓶中充分洗滌細(xì)胞表面，以洗去瓶中殘留的培養(yǎng)基，倒掉PBS，重復(fù)以上操作2-3遍。在 最后一次洗滌中盡可能吸干殘留的PBS，盡量在冰上操作。2、 向培養(yǎng)瓶中加入冷的RIPA裂解緩沖液（每75cm2培養(yǎng)瓶加1ml）.然后用細(xì)胞刮子沿著 瓶壁開始刮細(xì)胞，如果所需要刮的同種細(xì)胞有多瓶，則將第一瓶刮下的細(xì)胞液吸出轉(zhuǎn)入下一 瓶中繼續(xù)刮（由于處理后的細(xì)胞裂解液較粘稠，所以宜用直徑大點(diǎn)的吸液管吸?。?。3、 吸出刮好的細(xì)胞裂解液置于14ml離心

3、管中（置于冰上），然后重復(fù)步驟2以刮取剩下 的細(xì)胞。4、盡可能將多的細(xì)胞裂解液收集到14ml的離心管中，樣品插入冰盒進(jìn)行超聲，超聲強(qiáng)度以 不產(chǎn)生泡沫為準(zhǔn)，超聲每次2-3秒，重復(fù)3-4次。如仍有細(xì)胞碎片或沉淀，應(yīng)離心10000rpm,10 分鐘，留取上清。5、取出小量細(xì)胞裂解液測其蛋白濃度（用Biorad Bradford試劑盒或紫外分光光度計(jì)，在 A280測定），分裝保存在-70C。4方法二NP-40 or Triton-100 1%TrisHCl （pH 8.0） 50mmol/LNaCl 150mmol/LPMSF （苯甲基磺酰氟）0.1mmol/L（100ng/ml）Pepstatin（

4、胃蛋白酶抑制劑）1 u mol/L（0.7 u g/ml）Leupeptin （亮抑制肽）0.5mg/mlAprotinin （抑蛋白酶肽）0.3 u mol/L（1 u g/ml）（注：PMSF貯存液：100mmol/L 即 17.4mg/ml于異丙醇中；Aprotinin 貯存液：10mg/ml 溶于 0.01mol/LHEPES（pH8.0）;Leupeptin貯存液：10mg/ml溶于水中；Pepstatin貯存液10mg/ml于甲醇液中.均于-20C保存）裂解操作程序：*離心收集1X107個(gè)細(xì)胞*加入4。預(yù)冷1%NP-40裂解液100 Pl*劇烈震蕩使細(xì)胞充分懸浮混勻（如為組織進(jìn)行勻

5、漿）4C放置 1530min4。離心，15 000rpm,10min,取上清備用。方法三*細(xì)胞裂解液的主要目的：1.利用去污劑破壞脂質(zhì)雙分子層，破裂細(xì)胞；2.溶解蛋白；3.蛋 白變性使其穩(wěn)定；4.抑制蛋白酶活性推薦 RIPA buffer:.50 mM Tris-HCl pH 7.4 緩沖體系150 mM NaCl等滲體系-1 mM PMSF強(qiáng)大的蛋白酶抑制劑1 mM EDTA變性劑和穩(wěn)定劑5 Pg/ml Aprotinin （抑肽酶）蛋白酶抑制劑5 Pg/ml Leupeptin蛋白酶抑制劑1% Triton x-100 破壞細(xì)胞1% Sodium deoxycholate中度變性劑和蛋白溶

6、解劑細(xì)胞裂解液的主要目的：1.利用去污劑破壞脂質(zhì)雙分子層，破裂細(xì)胞；2. 溶解蛋白；3. 蛋 白變性使其穩(wěn)定；4. 抑制蛋白酶活性推薦 RIPA buffer:.50 mM Tris-HCl pH 7.4 緩沖體系150 mM NaCl等滲體系1 mM PMSF強(qiáng)大的蛋白酶抑制劑1 mM EDTA變性劑和穩(wěn)定劑5 pg/ml Aprotinin蛋白酶抑制劑5 Pg/ml Leupeptin 蛋白酶抑制劑1% Triton x-100 破壞細(xì)胞1% Sodium deoxycholate中度變性劑和蛋白溶解劑0.1% SDS強(qiáng)變性劑和蛋白溶解劑其中PMSF等蛋白酶抑制劑最好另外配制，一20C保存

7、，用前混合。蛋白酶抑制劑較貴，如 果你的經(jīng)費(fèi)有限，可以僅用PMSF試一試，能出結(jié)果就可以。*用于普通的Western、IP或co-IP，我們推薦使用Western及IP細(xì)胞裂解液（P0013），該裂 解液已被國內(nèi)各大研究機(jī)構(gòu)廣泛使用，用戶普遍反映很好。裂解細(xì)胞或組織后，沒有非常粘 滯的透明狀DNA團(tuán)塊形成，不必采用超聲處理等就可以非常理想地用于后續(xù)操作。另外該 裂解液裂解的產(chǎn)物也適合用于磷酸化蛋白的Western檢測。對于某些特殊蛋白的IP，如果發(fā) 現(xiàn)Western及IP細(xì)胞裂解液（P0013）效果不是非常理想，可以嘗試用RIPA裂解液（強(qiáng)、中或弱） 或NP-40裂解液。如果發(fā)現(xiàn)IP的時(shí)候背景

8、很高，即非特異的蛋白也被IP下來，則需要選用 裂解強(qiáng)度較高的裂解液，例如RIPA裂解液（強(qiáng)或中）。如果發(fā)現(xiàn)目的蛋白無法被IP下來，則 說明裂解液的強(qiáng)度過強(qiáng)，可以使用較為溫和的裂解液例如RIPA裂解液（弱）或NP-40裂解液。 對于某些難溶解蛋白的Western,如果發(fā)現(xiàn)Western及IP細(xì)胞裂解液效果不是非常理想，可 以嘗試使用裂解強(qiáng)度更高的裂解液，例如RIPA裂解液(強(qiáng)、中)或SDS裂解液。RIPA裂解體系：150 mmoL/L Nacl，1.0% NP-40 或 Triton-x-100，0.5%脫氧膽酸鈉，0.1% SDS，50 mmoL/L Tris ( ph8.0)。一、組織裂解液

9、配制組織裂解液配方：7MUrea(60. 06)4.2042 g2Mthiourea(76.12)1.5224 g100mMDTT0.1543 g4%CHAPS0.4g0.5mMEDTA0.00146 g40MmTris0.0485 g2%(v/v)NP-400.2 ml1%(v/v)Triton X-1000.1 ml5mMPMSF用前加0.00871 g2%pharmalyte0.2ml共10ml分裝成400 u 1/每管(可應(yīng)用于30-80毫克組織裂解)注：已配好分裝成400 u 1/每管可供應(yīng)用不需另配！細(xì)胞裂解液配方：6M Urea(60. 06)1.8018 g2M thioure

10、a(76.12) 0. 7613 g65mM DTT0.050 g4% CHAPS 0.2 g40Mm Trisbase 0.02425 g共5ml分裝成200 u 1/每管(可應(yīng)用于50-100m1培養(yǎng)瓶內(nèi)的細(xì)胞裂解)細(xì)胞裂解液：組織裂解液配方：7 mol/L 尿素、7MUrea(60. 06)4.2042 g2 mol/L硫月尿、2Mthiourea(76.12) 1.5224 g2% NP-40、2%(v/v)NP-400.2 ml1% Triton X-100、1%(v/v)Triton X-1000.1 ml65 mmol/L DTT、0.1003g 100mM DTT0.1543

11、g5 mmol/L PMSF、5mMPMSF用前加0.00871 g4% CHAPS、4%CHAPS0.4g40 mmol/L Tris、40MmTris0.0485 g2% pharmalyte (pH3-10)、2%pharma1yte0.2ml0.5mM EDTA 0.00146 g25 mg/L DNase I、7 mg/L RNase A、20 mg/L aprotinin、20 mg/L leupeptin、2 mmol/L Na3VO4、Phosphatase Inhibitor Cocktail 1Phosphatase Inhibitor Cocktail 21ml水化液配方：8M Urea（60.06）0.48048 g2% CHAPS 0.02 g痕量漠酚蘭0.4 U l1%的痕量漠酚蘭（10mg+1000ul雙蒸水）450 U l 水化液 力口 DTT 0.00135mgor 400 U l 水化液 力口 DTT 0.00126mg各種細(xì)胞裂解液的功用都分別是什么，SDS , NP-40 , TritonX-100有何作用SDS , NP-40 , TritonX-100這三種去垢劑的作用是不同的，或者說作用力量強(qiáng)弱不同。SDS屬于離子型去垢劑，最厲害，基本可以把細(xì)胞完全破掉，DNA會釋放出來，裂解液變得 很粘稠。NP-40是很溫和