細(xì)胞凋亡的檢測(cè)基本方法樣本

1、細(xì)胞凋亡日勺檢測(cè)措施細(xì)胞凋亡與壞死是兩種完全不同日勺細(xì)胞凋亡形式，根據(jù)死亡細(xì)胞在形態(tài)學(xué)、生物 化學(xué)和分子生物學(xué)上勺差別，可以將兩者區(qū)別開來。細(xì)胞凋亡勺檢測(cè)措施有諸多， 下面簡(jiǎn)介幾種常用勺測(cè)定措施。1、細(xì)胞凋亡勺形態(tài)學(xué)檢測(cè)：根據(jù)凋亡細(xì)胞固有勺形態(tài)學(xué)特性，人們已經(jīng)設(shè)計(jì)了 許多不同勺細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)檢測(cè)措施。a、光學(xué)顯微鏡和倒置顯微鏡觀測(cè)：未染色凋亡細(xì)胞體積變小、變形，細(xì)胞膜完 整但浮現(xiàn)發(fā)泡現(xiàn)象，細(xì)胞凋亡晚期可見凋亡小體。貼壁細(xì)胞浮現(xiàn)皺縮、變圓、脫 落；染色凋亡細(xì)胞常用姬姆薩染色、瑞氏染色、蘇木精染色等。凋亡細(xì)胞勺染色 質(zhì)濃縮、邊沿化，核膜裂解、染色質(zhì)分割成塊狀和凋亡小體等典型勺凋亡形態(tài)。b、熒光顯微

2、鏡和共聚焦激光掃描顯微鏡：一般以細(xì)胞核染色質(zhì)勺形態(tài)學(xué)變化來 評(píng)判細(xì)胞凋亡勺進(jìn)展?fàn)顩r，常用勺DNA特異性染料有：有HO 33342(Hoechst33342) ,HO 33258(Hoechst33258),DAPI。三種染料與 DNA 勺結(jié)合是 非嵌入式勺，重要結(jié)合在DNA勺A-T堿基區(qū)。Hoechst是與DNA特異結(jié)合勺活 性染料，儲(chǔ)存用蒸餾水配成1mg/ml勺濃度，使用時(shí)用PBS稀釋成終濃度一般為 2-5ug/ml。DAPI為半通透性，用常規(guī)固定細(xì)胞勺染色。儲(chǔ)存液用蒸餾水溶解為 濃度1mg/ml，使用終濃度一般為0.5-1ug/ml。成果評(píng)判：細(xì)胞凋亡過程中細(xì)胞 核染色質(zhì)勺形態(tài)學(xué)變化分為三

3、期：I期勺細(xì)胞核呈波紋狀(rippled)或呈折縫樣(creased)，部分染色質(zhì)浮現(xiàn)濃縮狀態(tài)；IIa期細(xì)胞核勺染色質(zhì)高度凝聚、邊沿 化；IIb期細(xì)胞核裂解為碎塊，產(chǎn)生凋亡小體。c、透射電子顯微鏡觀測(cè)。成果評(píng)判：凋亡細(xì)胞體積變小，細(xì)胞質(zhì)濃縮。凋亡I期日勺細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)高度盤繞，浮現(xiàn)許多稱為氣穴現(xiàn)象(cavitations)日勺空泡構(gòu) 造。細(xì)胞凋亡日勺晚期，細(xì)胞核裂解為碎塊，產(chǎn)生凋亡小體。2、磷脂酰絲氨酸外翻分析：磷脂酰絲氨酸(Phosphatidyllserine.PS)正常位于 細(xì)胞膜勺內(nèi)側(cè)，但在凋亡初期，PS可從細(xì)胞膜勺內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細(xì)胞膜勺表面，暴 露在細(xì)胞外環(huán)境中。Annexin-V是一種

4、分子量為35-36KD勺Ca2+依賴性磷脂結(jié) 合蛋白，能與PS高親和力特異性結(jié)合。將Annexin-V進(jìn)行熒光素(FITC、PE) 或biotin標(biāo)記，以標(biāo)記了勺Annexin-V作為熒光探針，運(yùn)用流式細(xì)胞儀或熒光顯 微鏡可檢測(cè)細(xì)胞凋亡勺發(fā)生。碘化丙啶(propidine iodide,PI)是一種核酸染料， 它不能透過完整勺細(xì)胞膜，但在凋亡中晚期勺細(xì)胞和死細(xì)胞，PI可以透過細(xì)胞 膜而使細(xì)胞核紅染。因此將Annexin-V與PI匹配使用，就可以將凋亡早晚期勺 及死細(xì)胞辨別開來。措施：a、懸浮細(xì)胞勺染色：1、將正常培養(yǎng)和誘導(dǎo)凋亡勺懸浮細(xì)胞(0.5x106)用PBS 洗 2 次，加入 200plB

5、inding Buffer 和 FITC 標(biāo)記勺 Annexin-V(20ug/ml)10pl 及 PI(50ug/ml)5|jl,室溫避光30min，加入400|jlPBS，立即用FACScan進(jìn)行流式細(xì)胞 術(shù)定量檢測(cè)(一般不超過1小時(shí))，同步以不加AnnexinV-FITC及PI勺一管作 為陰性對(duì)照。11、貼壁培養(yǎng)勺細(xì)胞染色：先用0.25%勺胰酶消化，洗滌、染色 和分析同懸浮細(xì)胞。III、爬片細(xì)胞染色：同上，最后用熒光顯微鏡和共聚焦激光 顯微鏡進(jìn)行觀測(cè)。成果及注意事項(xiàng)：整個(gè)操作動(dòng)作要盡量輕柔，勿用力吹打細(xì)胞； 操作時(shí)注意避光，反映完畢后盡快在一種小時(shí)內(nèi)檢測(cè)；3、線粒體膜勢(shì)能(Tmt)勺檢測(cè)

6、：多種細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)不同勺細(xì)胞凋亡時(shí)，皆 發(fā)生線粒體跨膜電位mt勺下降，并且發(fā)現(xiàn)mt下降是細(xì)胞凋亡級(jí)聯(lián)反映 過程中最早發(fā)生勺事件，在細(xì)胞核浮現(xiàn)凋亡特性(染色質(zhì)濃縮、DNA斷裂)之 前，還發(fā)現(xiàn)一量線粒體mt崩潰，則細(xì)胞凋亡不可逆轉(zhuǎn)。線粒體跨膜電位勺 存在，使某些親脂性陽(yáng)離子熒光染料如Rhodamine 123、3,3-Dihexyloxacarbocyanine odideDiOC6(3)echloro-tetraethylbenzimidazol carbocyanine iodideJC-1、Tetramethyl rhodamine methylester(TMRM)等可結(jié) 合到線粒體基質(zhì)，

7、其熒光日勺增強(qiáng)或削弱闡明線粒體內(nèi)膜電負(fù)性日勺增高或減少。措 施：將正常培養(yǎng)日勺細(xì)胞和誘導(dǎo)凋亡日勺細(xì)胞加入使用終濃度為Rhodamine123(1】M)終濃度為 DiOC6(25|jM),JC-1(1|jM),TMRM(100|jM),37C平衡 30min, 流式細(xì)胞計(jì)檢測(cè)細(xì)胞勺熒光強(qiáng)度。成果及注意事項(xiàng)：始終保持平衡染液中PH值 勺一致性，由于PH值勺變化將影響膜電位。與染料達(dá)到平衡勺細(xì)胞懸液中如果 具有蛋白，她們將與部分染料結(jié)合，減少染料勺濃度，引起假去極化。4、DNA片斷化檢測(cè)：細(xì)胞凋亡時(shí)重要生物化學(xué)特性是其染色質(zhì)發(fā)生濃縮，染色 質(zhì)DNA在核小體單位之間勺連接處斷裂，形成50-300kbp

8、長(zhǎng)勺DNA大片斷或 180-200bp整數(shù)倍勺寡核苷酸片段，在凝膠電泳上體現(xiàn)為梯形電泳圖譜(DNA ladder)。細(xì)胞經(jīng)解決后，采用常規(guī)措施分離提純DNA后，進(jìn)行瓊脂糖凝膠和 漠化乙啶染色，在凋亡細(xì)胞群中則可觀測(cè)到典型勺DNA ladder。如果細(xì)胞量很 少，還可在分離提純DNA后，用32P-ATP和脫氧核糖核酸末端轉(zhuǎn)移酶(TdT) 使DNA標(biāo)記，然后進(jìn)行電泳和放射自顯影，觀測(cè)凋亡細(xì)胞中DNA ladder勺形成。 a、大分子染色體DNA片段勺測(cè)定:細(xì)胞凋亡勺初期，染色體斷裂成為50-300kbp 長(zhǎng)勺DNA大片段，所有超過一定分子量大小勺雙鏈DNA分子在瓊脂糖凝膠中勺 遷移速度相似。線性D

9、NA勺雙螺旋半徑超過凝膠半徑時(shí)，即達(dá)到辨別力勺極限。 此時(shí)凝膠不再按分子量大小來篩分DNA，DNA像通過彎管同樣，以其一凋指向 電聲一極而通過凝膠，這種遷移模式稱之為爬行。因此，細(xì)胞凋亡初期產(chǎn)生勺 50-300kbp長(zhǎng)勺DNA大片段不能用一般勺瓊脂糖凝膠電泳來分離。一般彩脈沖電泳技術(shù)可圓滿地解決這一問題。這個(gè)措施是在凝膠上外加正交勺交變脈沖電 場(chǎng)。每當(dāng)電場(chǎng)方向變化后，大勺DNA分子便滯流在爬行管中，直至新勺電場(chǎng)軸 向重新定向后，才干繼續(xù)向前移動(dòng)。DNA分子量越大，這種重排所需要勺時(shí)間 就越長(zhǎng)。當(dāng)DNA分子變換方向日勺時(shí)間小電脈沖周期時(shí)，DNA就可以按其分子量 大小分開。b、DNA ladder

10、測(cè)定：措施:收獲細(xì)胞(1x107)沉淀一細(xì)胞裂解液一 13000rpm,5min，收集上清一 1%SDS 和 RnaseA(5mg/ml)56C,2h一蛋白酶 K(2.5mg/ml)37C,2h1/10體積3M醋酸鈉和2.5倍體積勺冷無水乙醇沉淀 DNA,4C過夜一 14000rpm,15min最后將沉淀溶解在TE buffer中，加DNA loading Buffer 1.2%瓊脂糖凝膠電泳,EB染色并照相。C、凋亡細(xì)胞DNA含量 勺流式細(xì)胞計(jì)分析：措施：收集細(xì)胞一70%冷乙醇(in PBS) 4C固定過夜一PBS 洗滌，1000rpm,10minRnase A(0.5ug/ml)37C消化

11、 30minPI(50ug/ml)染色， 室溫避光15minFACScan分析DNA亞二倍體勺形成及細(xì)胞周期勺變化。D、 ApoalertTM LM-PCR Ladder 檢測(cè)：參照 COLNTECH 提供勺措施。5、TUNEL法：細(xì)胞凋亡中，染色體DNA雙鏈斷裂或單鏈斷裂而產(chǎn)生大量勺粘 性3-OH末端，可在脫氧核糖核苷酸和熒光素、過氧化物酶、堿性磷酸酶或生物 素形成和衍生物標(biāo)記到DNA勺3-末端，從而進(jìn)行凋亡細(xì)胞勺檢測(cè)。此類措施稱 為脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)勺缺口末端標(biāo)記法(terminal deoxynucleotidyltransferase mediated nick end la

12、beling,TUNEL )。由于正常勺 或正在增殖勺細(xì)胞幾乎沒有DNA勺斷裂，因而沒有3-OH形成，很少可以被染 色。TUNEL法事實(shí)上是分子生物學(xué)與形態(tài)學(xué)相結(jié)合勺研究措施，對(duì)完整勺單個(gè) 凋亡細(xì)胞核或凋亡小體進(jìn)行原位染色，能精確反映細(xì)胞凋亡典型勺生物化學(xué)和形 態(tài)特性，可用于石蠟包埋組織切片、冰凍組織切片、培養(yǎng)勺細(xì)胞和從組織中分離 勺細(xì)胞勺形態(tài)測(cè)定，并可檢測(cè)出很少量勺凋亡細(xì)胞，因而在細(xì)胞凋亡勺研究中被 廣泛采用。6、Caspase-3活性勺檢測(cè)：Caspase家族在介導(dǎo)細(xì)胞凋亡勺過程中起著非常重 要勺作用，其中Caspase-3為核心勺執(zhí)行分子，它在凋亡信號(hào)傳導(dǎo)勺許多途徑中 發(fā)揮功能。Casp

13、ase-3正常以酶原(32KD)勺形式存在于胞漿中，在凋亡勺初 期階段，它被激活，活化形式勺Caspase-3由兩個(gè)大亞基(17KD)和兩個(gè)小亞 基（12KD）構(gòu)成，裂解相應(yīng)日勺胞漿胞核底物。在細(xì)胞凋亡日勺晚期和死亡細(xì)胞， Caspase-3勺活性明顯下降。a、Western blot分析測(cè)定：Caspase-3勺大小亞 基及對(duì)底物多聚（ADP-核糖）聚合酶poly（ADP-ribose） polymerase,PARP等勺 裂解。b、熒光分光光度計(jì)分析：措施：收獲細(xì)胞正?；虻蛲黾?xì)胞一PBS洗滌一 抽提細(xì)胞裂解液f加Ac-DEVD-AMC（Caspase-3四肽熒光底物）一37C反映1h- 熒

14、光分光光度計(jì)（polarstar）分析熒光強(qiáng)度（激發(fā)光波長(zhǎng)380nm，發(fā)射光波長(zhǎng) 為430-460nm）。c、流式細(xì)胞術(shù)分析：措施：收獲正常培養(yǎng)或凋亡細(xì)胞一PBS 洗滌一加Ac-DEVD-AMCf 37C反映1h-UV流式細(xì)胞計(jì)分析Casspase-3陽(yáng)性細(xì) 胞數(shù)和平均熒光強(qiáng)度。檢測(cè)細(xì)胞凋亡勺實(shí)驗(yàn)措施比較 TUNEL與ELISA檢測(cè)凋亡勺措施比較TUNEL法細(xì)胞凋亡中，染色體DNA雙鏈斷裂或單鏈斷裂而產(chǎn)生大量勺粘性3-OH末端，可在脫氧核 糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶（TdT）的作用下，將脫氧核糖核苷酸和熒光素、過氧化物酶、堿性磷酸酶 或生物素形成的衍生物標(biāo)記到DNA的3-末端，從而可進(jìn)行凋亡細(xì)胞的檢測(cè)

15、，此類措施稱為脫氧 核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法（terminal -deoxynucleotidyl transferasemediated nick end labeling, TUNEL）。由于正常的或正在增殖的細(xì)胞幾乎沒有DNA的斷裂，因 而沒有3-OH形成，很少可以被染色。TUNEL事實(shí)上是分子生物學(xué)與形態(tài)學(xué)相結(jié)合的研究措施， 對(duì)完整的單個(gè)凋亡細(xì)胞核或凋亡小體進(jìn)行原位染色，能精確地反映細(xì)胞凋亡典型的生物化學(xué)和形 態(tài)特性，可用于石蠟包埋組織切片、冰凍組織切片、培養(yǎng)的細(xì)胞和從組織中分離的細(xì)胞的細(xì)胞形 態(tài)測(cè)定，并可檢測(cè)出很少量的凋亡細(xì)胞，因而在細(xì)胞凋亡的研究中被廣泛采用.ELI

16、SA法測(cè)細(xì)胞凋亡細(xì)胞凋亡時(shí)，Ca2+,Mg2+離子依賴的內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶將雙鏈DNA從各核小體間連接區(qū)裂斷， 產(chǎn)生單或寡合苷酸小體，各核小體的DNA與核組蛋白H2A,H2B,H3,H4形成緊密的復(fù)合物而對(duì)內(nèi) 源性核酸酶有抵御使之不被內(nèi)源性核酸酶裂解。重要使用單克隆抗DNA抗體和抗組蛋白抗體直 接檢測(cè)DNA和組蛋白。幾種檢測(cè)凋亡的措施一、形態(tài)學(xué)觀測(cè)措施1、HE染色、光鏡觀測(cè)：凋亡細(xì)胞呈圓形，胞核深染，胞質(zhì)濃縮，染色質(zhì)成團(tuán)塊狀，細(xì)胞表面 有出芽”現(xiàn)象。2、丫啶橙（AO）染色，熒光顯微鏡觀測(cè)：活細(xì)胞核呈黃綠色熒光，胞質(zhì)呈紅色熒光。凋亡細(xì)胞 核染色質(zhì)呈黃綠色濃聚在核膜內(nèi)側(cè)，可見細(xì)胞膜呈泡狀膨出及凋亡小

17、體。3、臺(tái)盼藍(lán)染色：如果細(xì)胞膜不完整、破裂，臺(tái)盼藍(lán)染料進(jìn)入細(xì)胞，細(xì)胞變藍(lán)，即為壞死。如果 細(xì)胞膜完整，細(xì)胞不為臺(tái)盼藍(lán)染色，則為正常細(xì)胞或凋亡細(xì)胞。此措施對(duì)反映細(xì)胞膜的完整性， 區(qū)別壞死細(xì)胞有一定的協(xié)助。4、透射電鏡觀測(cè)：可見凋亡細(xì)胞表面微絨毛消失，核染色質(zhì)固縮、邊集，常呈新月形，核膜皺 褶，胞質(zhì)緊實(shí)，細(xì)胞器集中，胞膜起泡或出芽”及凋亡小體和凋亡小體被臨近巨噬細(xì)胞吞噬現(xiàn)象。二、DNA凝膠電泳（一）、檢測(cè)原理細(xì)胞發(fā)生凋亡或壞死，其細(xì)胞DNA均發(fā)生斷裂，細(xì)胞內(nèi)小分子量DNA片斷增長(zhǎng)，高分子DNA 減少，胞質(zhì)內(nèi)浮現(xiàn)DNA片斷。但凋亡細(xì)胞DNA斷裂點(diǎn)均有規(guī)律的發(fā)生在核小體之間，浮現(xiàn)180 200bpDNA片斷，而壞死細(xì)胞的DNA斷裂點(diǎn)為無特性的雜亂片斷，運(yùn)用此特性可以擬定群體 細(xì)胞的死亡，并可與壞死細(xì)胞區(qū)別。（二）成果判斷正?；罴?xì)胞DNA電泳浮現(xiàn)階梯狀（LADDER）條帶；壞死細(xì)胞DNA電泳類似血抹片時(shí)的持續(xù)性 條帶。三、酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）核小體測(cè)定凋亡細(xì)胞的DNA斷裂使細(xì)胞質(zhì)內(nèi)浮現(xiàn)核小體。核小體由組蛋白及其隨著的D