血清GPT活力的測定

1、 血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移 酶（ALT）活力的測定（改良賴氏法）同組人：陳孝煒，張極平，賴海洋1ALT酶活力單位的定義：1ml血清（反應(yīng)溶液總量為3ml）在340nm波長下，用內(nèi)徑為1.0cm的比色皿，在25，1min內(nèi)生成的丙酮酸在乳酸脫氫酶催化下，使NADH和氫離子變成尼克酰胺嘌呤二核苷酸，輔酶，吸光度下降0.001為1個(gè)轉(zhuǎn)氨酶活力單位。丙氨酸+-酮戊二酸 谷氨酸+丙酮酸丙酮酸+NADH 乳酸+尼克酰胺嘌呤二核苷酸，輔酶ALT 乳酸脫氫酶2實(shí)驗(yàn)?zāi)康? 了解血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶活力單位的定義2 掌握血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶活力測定的方法（改良賴氏法）和臨床意義。3實(shí)驗(yàn)原理 在實(shí)驗(yàn)條件下，以丙氨酸和-酮

2、戊二酸作為底物，經(jīng)轉(zhuǎn)氨酶的作用，生成谷氨酸和丙酮酸，然后測定丙酮酸的生成量，即可計(jì)算酶活力的大小。 生成的丙酮酸與2，4-二硝基苯腙，后者在堿性環(huán)境中呈現(xiàn)紅棕色，顏色的深淺與丙酮酸含量成正比。與標(biāo)準(zhǔn)丙酮酸的顯色進(jìn)行比較，即可測定丙酮酸的含量。4兩個(gè)反應(yīng)式為：丙氨酸+-酮戊二酸 谷氨酸+丙酮酸 丙酮酸+2，4-二硝基苯肼 H2O+丙酮酸-2，4-二硝基苯腙ALT氫氧根5-酮戊二酸也能與2，4硝基苯肼結(jié)合生成相應(yīng)的苯腙，在堿性條件下顯色。兩種苯腙的吸收光譜有差異，在520nm 比色時(shí)，丙酮酸-2，4-二硝基苯腙的吸光度值遠(yuǎn)較-酮戊二酸苯腙的高。反應(yīng)30分鐘后，-酮戊二酸減少而丙酮酸量增加，在一定范

3、圍內(nèi)，520nm處吸光度增加的程度與反應(yīng)體系中丙酮酸與-酮戊二酸的物質(zhì)的量之比呈線性關(guān)系。6實(shí)驗(yàn)試劑1：ALT底物液，即2mmol L -酮戊二酸，20mmol/L丙氨酸。2:pH=7.4的磷酸緩沖液（PBS）3：丙酮酸標(biāo)準(zhǔn)液（2 mmol/L）4:2,4-二硝基苯肼溶液（1mmol/L）5:0.4mol/LNaOH7實(shí)驗(yàn)操作 1標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：取5支試管，按下表操作編號01234丙酮酸標(biāo)準(zhǔn)液/mL0.000.050.100.150,20ALT底物試劑/mL0.500.450.400.350.300.1mol/L磷酸鹽緩沖液（pH=7.4)/mL0.100.100.100.100.102,4-

4、二硝基苯肼液/mL 0.500.500.500.500.50 混勻，置37水浴20分鐘0.4mol/LNaOH/Ml5.05.05.05.05.0 相當(dāng)于ALT活力02857971508混勻，室溫放置10分鐘后以蒸餾水調(diào)零，用520 nm波長比色，讀取各管吸光度。各管的吸光度減去0號管的吸光度，然后以吸光度的差值為縱坐標(biāo)，各管相應(yīng)的轉(zhuǎn)氨酶活力單位為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。為了方便，可將各管的吸光度相當(dāng)于轉(zhuǎn)氨酶的卡門氏單位列于其后。2 酶活力的測定：取試管兩支，注明測定管（T）及對照管（C），在測定前將底物液在37水浴中預(yù)溫5分鐘，再按下表操作。9 項(xiàng)目測定管（T）對照管（C）血清/L10ALT底

5、物液/mL0.500.50 混勻，置于37水浴中保溫30分鐘2，4二硝基苯肼液/mL0.500.50 混勻，置于37水浴中保溫20分鐘血清/L100.4mol/L NaOH/Ml5.005.0010混勻，室溫放置10min后，以蒸餾水調(diào)零，在520nm波長處比色，讀取吸光度，用T管的吸光度減去C管的吸光度，查標(biāo)準(zhǔn)曲線，即得到待測血清中所含ALT的酶活力。參考值：525卡門氏單位11臨床意義ALT廣泛存在于機(jī)體的各種組織中，但在肝細(xì)胞中含量最多。當(dāng)肝臟有病變特別是急性肝炎及肝細(xì)胞壞死時(shí)，血清中ALT活力顯著升高。在肝癌，肝硬變以及膽道疾病時(shí)，此酶活力也可中度或輕度增高。另外，其他臟器或組織的疾病，該酶活力也升高。12注意事項(xiàng)1 不同血清標(biāo)本的對照管吸光度基本相同，因此同一批標(biāo)本只做23個(gè)血清對照管，求其平均值即可，也可用空白管代替對照管。但對嚴(yán)重脂血癥，溶血的血清或超過正常值的血清進(jìn)行復(fù)查時(shí)，每份標(biāo)本均應(yīng)做血清對照管。2 賴氏法標(biāo)準(zhǔn)曲線只到97卡門氏單位，其線性關(guān)系良好。超過此活力的標(biāo)本，應(yīng)將血清稀釋后再測定，結(jié)果乘以稀釋倍數(shù)。133 ALT底物液與2，4 二硝基苯肼液的配制要準(zhǔn)確，每次測定時(shí)空白管的吸光度值上,下波動(dòng)不應(yīng)超過0.015。如超出此范圍應(yīng)檢查試劑及儀器等方面的問題。4 初了丙酮酸與2，4-二硝基苯肼在堿性