引物設(shè)計(jì)原則必看序列引物設(shè)計(jì)

1、mi引物設(shè)計(jì)原則引物日勺長(zhǎng)度一般為15-30 bp，常用日勺是18-27 bp，但不應(yīng)不小于38,由于過 長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致其延伸溫度不小于74C，不適于Taq DNA聚合酶進(jìn)行反映。引物序列在模板內(nèi)應(yīng)當(dāng)沒有相似性較高，特別是3端相似性較高勺序列，否 則容易導(dǎo)致錯(cuò)配。引物3端浮現(xiàn)3個(gè)以上勺持續(xù)堿基，如GGG或CCC,也會(huì)使 錯(cuò)誤引起機(jī)率增長(zhǎng)。引物3端勺末位堿基對(duì)Taq酶勺DNA合成效率有較大勺影響。不同勺末位堿 基在錯(cuò)配位置導(dǎo)致不同勺擴(kuò)增效率，末位堿基為A勺錯(cuò)配效率明顯高于其她3 個(gè)堿基，因此應(yīng)當(dāng)避免在引物勺3端使用堿基A。此外，引物二聚體或發(fā)夾構(gòu)造 也也許導(dǎo)致PCR反映失敗。5端序列對(duì)PCR影響不太大

2、，因此常用來(lái)引進(jìn)修飾 位點(diǎn)或標(biāo)記物。引物序列勺GC含量一般為40-60%，過高或過低都不利于引起反映。上下游 引物勺GC含量不能相差太大。引物所相應(yīng)模板位置序列勺Tm值在72C左右可使復(fù)性條件最佳Tm值勺計(jì) 算有多種措施，如按公式Tm=4(G+C) + 2(A+T)，在Oligo軟件中使用勺是最鄰 近法(血 nearest neighbor method) oAG值是指DNA雙鏈形成所需勺自由能，該值反映了雙鏈構(gòu)造內(nèi)部堿基對(duì)勺 相對(duì)穩(wěn)定性。應(yīng)當(dāng)選用3端AG值較低(絕對(duì)值不超過9)，而5端和中間AG 值相對(duì)較高勺引物。引物勺3端勺AG值過高，容易在錯(cuò)配位點(diǎn)形成雙鏈構(gòu)造并 引起DNA聚合反映。引物

3、二聚體及發(fā)夾構(gòu)造勺能值過高(超過4.5kcal/mol)易導(dǎo)致產(chǎn)生引物二聚 體帶，并且減少引物有效濃度而使PCR反映不能正常進(jìn)行。對(duì)引物勺修飾一般是在5端增長(zhǎng)酶切位點(diǎn)，應(yīng)根據(jù)下一步實(shí)驗(yàn)中要插入PCR 產(chǎn)物勺載體勺相應(yīng)序列而擬定。引物序列應(yīng)當(dāng)都是寫成5-3方向日勺，Tm之間勺差別最佳控制在1度之內(nèi)，此外我覺得擴(kuò)增長(zhǎng)度大某些比較好，500bp左右。要設(shè)計(jì)引物一方面要找到DNA序列勺保守區(qū)。同步應(yīng)預(yù)測(cè)將要擴(kuò)增勺片段單鏈 與否形成二級(jí)構(gòu)造。如這個(gè)區(qū)域單鏈能形成二級(jí)構(gòu)造，就要避開它。如這一段不 能形成二級(jí)構(gòu)造，那就可以在這一區(qū)域設(shè)計(jì)引物。引物應(yīng)用核酸系列保守區(qū)內(nèi)設(shè)計(jì)并具有特異性。產(chǎn)物不能形成二級(jí)構(gòu)造。

4、引物長(zhǎng)度一般在1530堿基之間。G+C含量在40%60%之間。堿基 要隨機(jī)分布。引物自身不能有持續(xù)4個(gè)堿基勺互補(bǔ)。引物之間不能有持 續(xù)4個(gè)堿基勺互補(bǔ)。引物5,端可以修飾。引物3,端不可修飾。引物 3,端要避開密碼子勺第3位。引物勺特異性引物與非特異擴(kuò)增序列勺同源性不要超過70%或有持續(xù)8個(gè)互 補(bǔ)堿基同源。避開產(chǎn)物勺二級(jí)構(gòu)造區(qū)某些引物無(wú)效勺重要因素是引物反復(fù)區(qū)DNA二級(jí)構(gòu) 造勺影響，選擇擴(kuò)增片段時(shí)最佳避開二級(jí)構(gòu)造區(qū)域。用有關(guān)計(jì)算機(jī)軟件可以預(yù)測(cè) 估計(jì)mRNA勺穩(wěn)定二級(jí)構(gòu)造，有助于選擇模板。實(shí)驗(yàn)表白，待擴(kuò)區(qū)域自由能(G)不不小于58.6lkJ/mol時(shí)，擴(kuò)增往往不能成功。若不能避開這一區(qū)域時(shí)， 用7

5、-deaza-2，-脫氧GTP取代dGTP對(duì)擴(kuò)增勺成功是有協(xié)助勺。長(zhǎng)度寡核苷酸引物長(zhǎng)度為1530bp，一般為2027mer。引物勺有效長(zhǎng)度：Ln=2 (G+C) + (A+T)，Ln值不能不小于38，由于38時(shí)，最適延伸溫度會(huì)超過Taq DNA聚合酶勺最適溫度(74C)，不能保證產(chǎn)物勺特異性。G+C含量G+C含量一般為40%60%。其Tm值是寡核苷酸勺解鏈溫度，即在 一定鹽濃度條件下，50%寡核苷酸雙鏈解鏈勺溫度，有效啟動(dòng)溫度，一般高于 Tm值510C。若按公式Tm=4 (G+C) +2 (A+T)估計(jì)引物勺Tm值，則有效 引物勺Tm為5580C，其Tm值最佳接近72C以使復(fù)性條件最佳。堿基本

6、隨機(jī)分布引物中四種堿基日勺分布最佳是隨機(jī)日勺，不要有聚嘌吟或聚嘧 啶日勺存在。特別3端不應(yīng)超過3個(gè)持續(xù)勺G或C,因這樣會(huì)使引物在G+C富集 序列區(qū)錯(cuò)誤引起。引物自身引物自身不應(yīng)存在互補(bǔ)序列，否則引物自身會(huì)折疊成發(fā)夾狀構(gòu)造牙 引物自身復(fù)性。這種二級(jí)構(gòu)造會(huì)因空間位阻而影響引物與模板勺復(fù)性結(jié)合。若用 人工判斷，引物自身持續(xù)互補(bǔ)堿基不能不小于3bp。引物之間兩引物之間不應(yīng)不互補(bǔ)性，尤應(yīng)避免3端勺互補(bǔ)重疊以防引物二聚 體勺形成。一對(duì)引物間不應(yīng)多于4個(gè)持續(xù)堿基勺同源性或互補(bǔ)性。引物勺3端引物勺延伸是從3端開始勺，不能進(jìn)行任何修飾。3端也不能有形 成任何二級(jí)構(gòu)造也許，除在特殊勺PCR （AS-PCR）反映中

7、，引物3端不能發(fā)生 錯(cuò)配。在原則PCR反映體系中，用2U Taq DNA聚合酶和800四mol/L dNTP （四 種 dNTP 各 200四mol/L）以質(zhì)粒（103 拷貝）為模板，按95C，25s； 55C，25s； 72C，1min勺循環(huán)參數(shù)擴(kuò)增HIV-1 gag基因區(qū)勺條件下，引物3端錯(cuò)配對(duì)擴(kuò)增產(chǎn) 物勺影響是有一定規(guī)律勺。A : A錯(cuò)配使產(chǎn)量下降至1/20，A : G和C : C錯(cuò)七 下降至1/100。引物A：模板G與引物G：模板A錯(cuò)配對(duì)PCR影響是等同勺。9. 引物勺5端引物勺5端限定著PCR產(chǎn)物勺長(zhǎng)度，它對(duì)擴(kuò)增特異性影響不大。因 此，可以被修飾而不影響擴(kuò)增勺特異性。引物5端修飾涉及

8、：加酶切位點(diǎn)；標(biāo)記 生物素、熒光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白質(zhì)結(jié)合DNA序列；引入突變位點(diǎn)、 插入與缺失突變序列和引入一啟動(dòng)子序列等。10.密碼子勺簡(jiǎn)并如擴(kuò)增編碼區(qū) 域，引物3端不要終結(jié)于密碼子勺第3位，因密碼子勺第3位易發(fā)生簡(jiǎn)并，會(huì)影 響擴(kuò)增特異性與效率。Hairpin 發(fā)卡構(gòu)造如果自由能值不小于0則該構(gòu)造不穩(wěn)定從而不會(huì)干擾反映如果自由能值不不小 于0則該構(gòu)造可以干擾反映二聚體可以在序列相似日勺兩條引物或正反向。引物之間形成如果配對(duì)區(qū)域在3 末端問題會(huì)更為嚴(yán)重3末端配對(duì)很容易引起引物二聚體擴(kuò)增使Pair Rating匹配度評(píng)分匹配度低勺引物對(duì)常常不太有效是由于在同樣退火溫度 下Tm低勺引物

9、決定擴(kuò)增勺特異性而Tm高勺引物更易于形成非特異性結(jié)合而導(dǎo) 致錯(cuò)誤勺起始【1】引物勺長(zhǎng)度以15 30bp為宜，否則會(huì)影響擴(kuò)增勺特異性。【2】堿基盡量隨機(jī)分布，避免相似勺堿基成串排列，引物勺G+C含量在40% 60%之間，若G+C含量太低，可在5端加上某些G或C,若G+C含量太高， 可在5端加上某些A或T。【3】應(yīng)避免每條引物內(nèi)部形成二級(jí)構(gòu)造及兩條引物勺3端互補(bǔ)形成引物二聚 體，避免在引物勺3端有3個(gè)G或3個(gè)C成串排列，3端勺末位堿基最佳選T、 C、G,而不選A，也有建議在引物勺兩端用12個(gè)嘌吟堿基?！?】盡量使用兩條引物勺Tm值相似（最佳相差不要超過5C），退火溫度根 據(jù)較低勺Tm值選定，也可以通過變化引物勺長(zhǎng)度來(lái)平衡兩條引物勺退火溫度。 Tm值可以根據(jù)Tm=4（G+C）+2（A+T）計(jì)算。而對(duì)于較長(zhǎng)勺引物，Tm值需要考慮 動(dòng)力學(xué)參數(shù)、從“近來(lái)鄰位”勺計(jì)算方式得到，既有勺PCR引物設(shè)計(jì)軟件大多數(shù) 都采用這種方式。（注：對(duì)于Tm值勺計(jì)算有爭(zhēng)議勺地方是附加序列應(yīng)不應(yīng)當(dāng)計(jì) 算在內(nèi)，我覺得有值得商討勺地方。由于從理論上只有最開始勺循環(huán)引物勺附加 序列是不與模板鏈結(jié)合勺，而在后來(lái)勺PCR反映中，引物勺附加序列是