全長(zhǎng)cDNA文庫的構(gòu)建-SMART技術(shù)

1、【共享】全長(zhǎng)cDNA文庫的構(gòu)建一 SMART技術(shù)全長(zhǎng)cDNA文庫的構(gòu)建一SMART技術(shù) 真核細(xì)胞的mRNA在加工過程中有一個(gè)比喻為穿鞋戴帽的過程，因此mRNA 的末端都帶有一段Poly A,這是利用逆轉(zhuǎn)錄酶制備cDNA文庫的基礎(chǔ)。但是由 于cDNA的5端的序列各不相同，如何獲得全長(zhǎng)的cDNA，如何擴(kuò)增由 微量的 mRNA 逆轉(zhuǎn)錄得到的 cDNA 文庫、如何利用已知片斷序列得到全長(zhǎng)的 cDNA （即RACE），曾經(jīng)是一個(gè)令人困擾的問題。常見的做法是在合成 cDNA 的雙鏈后在兩端連上接頭，利用已知的接頭序列再 進(jìn)行擴(kuò)增，或者是利用末端轉(zhuǎn)移酶在雙鏈 cDNA 的 3末端加上一連串的 G或者C （或

2、者A/T），再通過補(bǔ)齊粘末端，利用已知的兩頭序列進(jìn)行擴(kuò)增。但 是這些方法不同程度的存在一些問題，比如接頭的連接效率非常有限，會(huì)導(dǎo)致部 分信息的丟失，再加上這些方法需要多次用不同的酶處理有限的樣品，需要經(jīng)過 反復(fù)的純化，會(huì)損失很多有用的信息，特別是少量樣品中的低豐度信息，很大程 度上會(huì)影響結(jié)果的準(zhǔn)確性。另外由于 mRNA 容易部分降解，很難確定得到的 cDNA是否就是全長(zhǎng)的cDNA，還是cDNA的片斷。SMART技術(shù)的出現(xiàn)是一個(gè)新的里程碑。這個(gè)稱作Switching Mechanism At 5 end of the RNA Transcript（SMART）,原理實(shí)際上非常簡(jiǎn)單：在合 成cDN

3、A的反應(yīng)中事先加入的3末端帶Oligo （dG）的SMART引物， 由于逆轉(zhuǎn)錄酶以mRNA為模板合成cDNA，在到達(dá)mRNA的5末端時(shí) 碰到真核mRNA特有的帽子結(jié)構(gòu)，即甲基化的G時(shí)會(huì)連續(xù)在合成的cDNA末 端加上幾個(gè)（dC）, SMART引物的Oligo（dG）與合成cDNA末端突出的幾 個(gè)C配對(duì)后形成cDNA的延伸模板，逆轉(zhuǎn)錄酶會(huì)自動(dòng)轉(zhuǎn)換模板，以SMART引 物作為延伸模板繼續(xù)延伸 cDNA 單鏈直到引物的末端，這樣得到的所有 cDNA 單鏈的一端有含Oligo（dT）的起始引物序列，另一端有已知的SMART引物序 列，合成第二鏈后可以利用通用引物進(jìn)行擴(kuò)增。由于有 5帽子結(jié)構(gòu)的 mRNA才

4、能利用這個(gè)反應(yīng)得到能擴(kuò)增的cDNA，因此擴(kuò)增得到的cDNA就是全 長(zhǎng) cDNA。這個(gè)專利的方法是利用逆轉(zhuǎn)錄酶內(nèi)源的末端轉(zhuǎn)移酶活性，只要單管，一步即可完 成，不需要額外的 cDNA 抽提純化或者沉淀，或者額外的酶反應(yīng)，只需要少至 25ng的mRNA或者50ng的Total RNA就可以得到高質(zhì)量、高產(chǎn)量的cDNA 庫，更重要的是得到的cDNA能夠代表原有樣品中的mRNA的豐度，可以應(yīng)用 于直接擴(kuò)增基因、構(gòu)建cDNA文庫、已知序列釣全長(zhǎng)cDNA（RACE），和用于 芯片檢測(cè)的cDNA探針的擴(kuò)增等。我們?cè)谶@里分別介紹幾個(gè)采用SMART技術(shù)的產(chǎn)品：、 SMART PCR cDNA Synthesis

5、Kit這個(gè)試劑盒是采用 SMART 技術(shù)將少至 25ng 的 mRNA 或者 50ng 的 Total RNA制備成可大量擴(kuò)增的cDNA,提供包括SMART引物、CDS引物、PCR引 物、合成第一鏈 Buffer、dNTP、DTT、Advantage PCR Kit(15rxns)和純化 cDNA用的純化柱和對(duì)照RNA在內(nèi)的試劑。其中CDS引物是含有經(jīng)過修飾的 Oligo(dT)的起始引物，能特異結(jié)合在mRNA加Poly A的位置，避免結(jié)果有 過長(zhǎng)的Poly A影響后繼的測(cè)序或者PCR反應(yīng)，同時(shí)也可以作為PCR的3 引物。合成的cDNA可以直接進(jìn)行對(duì)數(shù)擴(kuò)增或者線性擴(kuò)增，可以作為定量PCR 的模

6、板，也可以直接用于Clontech的抑制性消減雜交，構(gòu)建cDNA文庫或者做 反向Northern雜交(Virtual Northern Blot)，還有用于芯片檢測(cè)的cDNA 探針制備。二、SMART cDNA Library Construction Kit常規(guī)的建庫需要在合成的 cDNA 雙鏈兩端通過連接加上相同或者不同的 adaptor，用相應(yīng)的酶切后可以插入載體中。由于連接效率低往往導(dǎo)致低豐度或 者是較長(zhǎng)的 cDNA 信息的丟失，使文庫偏重高豐度和較短的基因，失去應(yīng)有的 代表性。在做表達(dá)文庫時(shí)，如果 cDNA 的兩端是同一個(gè)酶切位點(diǎn)，由于 cDNA 可能按兩個(gè)不同的方向接入載體，反向接

7、入載體的那些 cDNA 不能正確表達(dá)， 因而有50%的可能丟失。然而用兩個(gè)不同的Adaptor又會(huì)涉及雙酶切以及雙酶 切是否完全的問題，影響產(chǎn)率。另外由于表達(dá)時(shí) 3 個(gè)堿基代表一個(gè)氨基酸，不 同的表達(dá)框架會(huì)得到不同的產(chǎn)物，因此正向插入一個(gè)表達(dá)載體的cDNA只有1/3 的可能得到正確的產(chǎn)物。雖然一度有ABC表達(dá)載體的解決方法，但是一段DNA 同時(shí)插入3個(gè)載體的機(jī)會(huì)是有限的。利用SMART技術(shù)建庫，可以得到全長(zhǎng)的cDNA文庫，也不需要Adaptor的連 接。這個(gè)試劑盒的SMART引物和CDS引物與前面的試劑盒略有不同，分別帶 有一個(gè)不完全相同的 SfiI 酶切位點(diǎn)。 SfiI 是一個(gè)在真核生物基因

8、組中極為稀少 的酶，出現(xiàn)的頻率要遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于Notl、EcoRI等識(shí)別6個(gè)堿基位點(diǎn)的酶。SfiI識(shí) 別序列為GGCCNNNN人NGGCC，中間的5個(gè)堿基為任意序列。因而兩個(gè)引物 分別帶有一個(gè)不完全相同的 SfiI 位點(diǎn)就是說兩個(gè)位點(diǎn)的中間 5 個(gè)堿基不同。這 樣經(jīng)過SMART技術(shù)合成兩端分別帶有SMART引物和CDS引物的cDNA經(jīng)過 擴(kuò)增后用SfiI單酶切，得到的是兩端的粘端不同的cDNA，這樣就可以定向插 入特定的載體中，不會(huì)浪費(fèi) 50%的信息。這個(gè)試劑盒提供的載體也很有特色：lambdaTriplex2載體有特別設(shè)計(jì)，可以用 3個(gè)不同的表達(dá)框架分別同時(shí)表達(dá)一段插入的DNA。這樣就保證插入的片

9、斷的 正確的表達(dá)產(chǎn)物能被篩選出來而不會(huì)漏掉。三、SMART RACE cDNA Amplification Kit對(duì)于DD-PCR或者SSH、RNA指紋、EST芯片等方法得到DNA片斷，要釣 全長(zhǎng)cDNA，或者用同源序列釣其他物種中的同源基因，3端的擴(kuò)增一般 都不成問題，難就難在 5端的片斷擴(kuò)增。利用 SMART 技術(shù)將 SMART 引物自動(dòng)加入cDNA的5端，不但能避免加接頭或者加一串堿基的麻煩， 而且能得到全長(zhǎng)的cDNA 5端。只要少至25個(gè)堿基的已知序列即可釣出全長(zhǎng)的 cDNA。四、Altas SMART Probe Amplification Kit由于DNA芯片上的點(diǎn)多，每個(gè)點(diǎn)的樣品量很有限，要足夠的靈敏度需要有足夠 多的探針。當(dāng)制備探針的樣品來源有限時(shí)，這個(gè)試劑盒就是解決辦法之一：利用 SMART技術(shù)可以將少至1000個(gè)細(xì)胞來源的RNA制備得到足夠的cDNA探針。 得到的探針能代表mRNA原有的豐度，而且操作簡(jiǎn)單。五、即將推出的Super SMART PC