(完整)丙型肝炎病毒核酸定量檢測(cè)作業(yè)指導(dǎo)書

1、完整丙型肝炎病毒核酸定量檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)作業(yè)指導(dǎo)書丙型肝炎病毒核酸定量檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)作業(yè)指導(dǎo)丙型肝炎病毒核酸定量檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)作業(yè)指導(dǎo)PAGE PAGE 6/9（生效日期：目的丙型肝炎病毒核酸定量檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)作業(yè)指導(dǎo)書采用 PCR技術(shù)、實(shí)時(shí)熒光探針技術(shù), 用于臨床血清或血漿標(biāo)本中的丙型肝炎病毒核酸的定性檢測(cè)， 適用于丙型肝炎病毒感染的輔助診斷.范圍適用于丙型肝炎病毒核酸定量檢測(cè)。3。 職責(zé)3。1 操作人員：負(fù)責(zé)標(biāo)本制備檢測(cè)、儀器操作、報(bào)告發(fā)送。專業(yè)組組長(zhǎng)作。實(shí)驗(yàn)室主任負(fù)責(zé)監(jiān)督和指導(dǎo)實(shí)驗(yàn)室各方面工作.4。 原理采用熒光 技術(shù)，以丙型肝炎病毒基因編碼區(qū)的高度保守區(qū)為靶區(qū)域，設(shè)計(jì)特異性引物及熒光探針， , 根據(jù)閾循環(huán)值現(xiàn)對(duì)

2、未知樣本的檢測(cè)。另外，本試劑盒帶有內(nèi)標(biāo)物質(zhì), 用于對(duì)核酸提取的整個(gè)過程進(jìn)行監(jiān)控, 減少假陰性結(jié)果的出現(xiàn)。5。 樣本要求5.1 適用標(biāo)本類型：血清5。2 標(biāo)本采集用一次性無菌注射器抽取受檢者靜脈血 2 ml注入無菌的真空采血管中（未加抗凝劑） 室溫（223060min 血標(biāo)本可自發(fā)完全凝集析出血清5min吸取上層血清， 1.5ml 滅菌離心管。5.3 標(biāo)本保存和運(yùn)送所采集的標(biāo)本可立即用于測(cè)試或長(zhǎng)期保存于 70，也可保存于20待測(cè)，保存期為 3 個(gè)月, 標(biāo)本應(yīng)避免反復(fù)凍融. 標(biāo)本運(yùn)送采用干冰（或者冰袋）保持低溫，運(yùn)輸時(shí)間不應(yīng)超過 4 天。5。4 拒收標(biāo)本: 拒絕重度溶血樣本、肝素抗凝的血漿.6。

3、儀器和試劑設(shè)備AB7500核酸擴(kuò)增儀、恒溫金屬浴、生物安全柜、低溫離心機(jī)等。試劑生產(chǎn)廠家：中ft大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)批號(hào)： YZB/國(guó)7271 2013最低檢出量：最低檢出量為 500 IU/ml試劑各組分見表 1：表 1試劑盒組分表組分名稱規(guī) 格數(shù) 量RNA提取液 A200 ul/ 管1核酸提取試劑RNA提取液 B5 ml/ 瓶2DEPC H2O3 ml/ 瓶1HCV內(nèi)標(biāo)溶液100 ul/ 管1PCR 檢測(cè)試劑HCV反應(yīng)液 A270 ul/ 管1HCV反應(yīng)液 B30 ul/ 管1陰性質(zhì)控品200 ul/ 管1質(zhì)控品HCV強(qiáng)陽性質(zhì)控品200 ul/ 管1HCV臨界陽性質(zhì)控品200

4、ul/ 管17。 操作步驟7。1 試劑準(zhǔn)備( 試劑儲(chǔ)存和準(zhǔn)備區(qū)）。1 記錄。反應(yīng)液配制7.1。2.1取出反應(yīng)液、反應(yīng)液室溫溶化后振蕩混勻，8000rpm離心數(shù)秒后使用.7。122取出 N個(gè)（N =待測(cè)樣本數(shù)+ 4 個(gè)陽性定量標(biāo)準(zhǔn)品+強(qiáng)陽性質(zhì)控品+臨界陽性質(zhì)控品陰性質(zhì)控品空白孔反應(yīng)管組分A組分AB總體積用量/ 人份27330將各組分充分混勻，混合好后進(jìn)行短時(shí)離心將管壁上的液體全部離心至管底，之后將 30 擴(kuò)增體系分裝到PCR反應(yīng)管, 反應(yīng)液分裝時(shí)盡量避免產(chǎn)生氣泡, 蓋緊管蓋，經(jīng)傳遞窗傳遞到標(biāo)本制備區(qū).75乙醇配制:取225l的PC，加入6。75l的無水乙醇, 振蕩混勻，配制成7乙醇，蓋緊蓋子，經(jīng)

5、傳遞窗傳遞到標(biāo)本制備區(qū)。7。2 RNA提?。?biāo)本制備區(qū)）7。2.1進(jìn)入標(biāo)本制備區(qū)，從傳遞窗中取出反應(yīng)管和75乙醇，放入標(biāo)本制備區(qū)冰箱冷藏。、B和內(nèi)標(biāo)液，放入生物安全柜內(nèi)室溫溶解，備用。65，使儀器自動(dòng)升溫。72.4 n 5 = 待測(cè)樣本數(shù)3 = 待測(cè)樣本數(shù)強(qiáng)陽性質(zhì)控品臨界陽性質(zhì)控品陰性質(zhì)控品）7。2。5 向離心管中各加入10 內(nèi)標(biāo)溶液，再分別加入200ul 樣本，800 提取液蓋緊管蓋，振蕩混勻15s 以充分混勻，室溫放置5min（每隔1min旋渦振蕩5s, 使裂解更充分，處理結(jié)束后瞬時(shí)離心.） 7。2.6加入200 無水乙醇,蓋緊管蓋，漩渦振蕩混勻15s 以充分混勻,瞬時(shí)離心，再加入20提液

6、漩渦振蕩混勻5s，室溫靜置1min.8000rpm 離心1min，小心吸棄上清。727再加入200lA提取液，蓋緊管蓋，充分混勻(用移液槍吹打，室溫下8000rm 離心1i,小心吸棄上清。7。2.8 加預(yù)冷的75400ul 充分混勻,8000rpm 1min，小心吸棄上清。7。2.9 加預(yù)冷的75400ul 充分混勻，8000rpm1min，小心吸棄上清.7.2.10打開管蓋，放入金屬浴，655min，使液體揮發(fā)完全.。11 溫育5min 后，用鑷子從金屬浴中取出離心管，加入 50DEPCH 用移液槍吹打混勻，室溫靜置1min后rpm離心離心管內(nèi)的上清液即為病毒核酸溶液,建議立即使用如需保存置

7、于-707。2.13取出已分裝好的 反應(yīng)管，向?qū)?yīng)編號(hào)的 管中加入處理好的的樣品(包括待測(cè)標(biāo)本、陰性質(zhì)控品、強(qiáng)陽性質(zhì)控品、臨界陽性質(zhì)控品)上清液各 20 空白對(duì)照不加模板，蓋緊反應(yīng)管。8000rpm離心數(shù)秒, 經(jīng)傳遞窗移至擴(kuò)增檢測(cè)區(qū)。（用移液槍小心吸取上清液，盡量不要碰到底層沉淀。）擴(kuò)增（擴(kuò)增區(qū))反應(yīng)管，放入儀器樣品槽內(nèi)。7.3。2 在“ Set 按對(duì)應(yīng)順序設(shè)置空白管、陰性質(zhì)控品、陽性室內(nèi)質(zhì)控品、臨界陽性質(zhì)控品、陽性定量參考品及待測(cè)標(biāo)本，并在slee 一欄中設(shè)置樣本名稱 , 探針檢測(cè)模式設(shè)置：eortere1 ：，Dye1:none ；Reporter Reference法參考75007.3.

8、3打開“ Method”50 15min ，1個(gè)循環(huán)；95 5min，1個(gè)循環(huán)；9415s5545s（收集熒光 個(gè)循環(huán)；7。3.4保存文件，運(yùn)行儀器。8。 結(jié)果分析體設(shè)置方1 Baseline 315，End 520Log 值，使閾值線位于擴(kuò)增曲線指數(shù)期, 調(diào)整陰性質(zhì)控品的擴(kuò)增曲線平直或低于閾值線。點(diǎn)擊 Report 界面查看結(jié)果，記錄樣本數(shù)值（8.2 檢測(cè)通道無明顯對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期品的 V 陰性。3如果反應(yīng)體系擴(kuò)增曲線在C檢測(cè)通道均有對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期且檢測(cè)通道45;或者擴(kuò)增曲線在檢測(cè)通道有對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期且45，在C檢測(cè)通道無對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期, 則判定樣品的V陽性性。9. 質(zhì)量控制每次實(shí)驗(yàn)均需檢測(cè)陰性質(zhì)控品、 HC

9、V強(qiáng)陽性質(zhì)控品、HCV臨界陽性質(zhì)控品。質(zhì)控品結(jié)果滿足質(zhì)量控制要求時(shí)方可進(jìn)行檢測(cè)結(jié)果的判斷.9。1 試劑盒自帶質(zhì)控(1 ）檢測(cè)通道擴(kuò)增曲線有明顯對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期。（2)HCV30，臨界陽性質(zhì)控品 FAM檢測(cè)通道 36。(3) 陽性定量參考品：增長(zhǎng)曲線呈 S 型曲線，且 0。97 r 1。9。2 室內(nèi)質(zhì)控每次實(shí)驗(yàn)應(yīng)選擇適當(dāng)?shù)腣質(zhì)控品做室內(nèi)質(zhì)控。9.3 以上要求(9.1 。2需在同一次實(shí)驗(yàn)中同時(shí)滿足，否則本次試驗(yàn)無效，需從新進(jìn)行。10。 干擾因素1。1環(huán)境中存在 s，可降解 ，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果假陰性, 實(shí)驗(yàn)用品需高壓滅菌后使用, 盡量避免污染.臨床標(biāo)本中內(nèi)源性抑制物: 血紅蛋白、免疫球蛋白、白細(xì)胞內(nèi)乳鐵蛋白、

10、脂類、等都可抑制 標(biāo)本應(yīng)避免溶血、脂血、黃疸等.外源性抑制物: 應(yīng)按采集要求采集，操作中應(yīng)小心謹(jǐn)慎，標(biāo)本容器及實(shí)驗(yàn)用具應(yīng)鑒定合格。, 防止交叉污染, 盡量使用帶鑒定合格的濾芯吸頭, 應(yīng)與標(biāo)本一起提取, 以及時(shí)發(fā)現(xiàn)交叉污染.1。 生物參考區(qū)間1010 2/l10 10 8/l12. 警示/V檢測(cè)無警示/危急值。13。 異常結(jié)果處理檢測(cè)結(jié)果與臨床診斷或資料, 通，查找原因并采取措施，于疑問報(bào)告發(fā)放處理記錄表中記錄處理過程 . 如需復(fù)查，需及時(shí)保存標(biāo)本。14. 臨床意義HCV感染診斷的指標(biāo)，指導(dǎo)臨床治療。15。 變異的潛在來源標(biāo)本保存不當(dāng)或反復(fù)凍融，都會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確。16。 注意事項(xiàng)。1 實(shí)驗(yàn)

11、過程中必須穿專用工作服、戴手套、口罩、帽子、必要時(shí)戴防護(hù)眼罩，接觸標(biāo)本后必須及時(shí)更換手套。2 陽性質(zhì)控品和檢測(cè)樣本均應(yīng)視為具有傳染性物質(zhì)，應(yīng)避免接觸到皮膚和粘膜。16.3實(shí)驗(yàn)過程必須嚴(yán)格分區(qū)操作，各區(qū)物品均為專用，不得交叉使用。4 樣品的處理操作應(yīng)在生物安全柜內(nèi)進(jìn)行。16。5 所用檢測(cè)試劑使用前應(yīng)完全解凍，瞬時(shí)離心后使用，應(yīng)避免反復(fù)凍融。6 否則請(qǐng)保存于20(24 ) 。7 操作過程中應(yīng)防止交叉污染，盡量使用鑒定合格的濾芯吸頭，陰性對(duì)照品應(yīng)與標(biāo)本一起提取。16。8 加樣時(shí)應(yīng)使樣品完全落入反應(yīng)液中，不應(yīng)有樣品粘附于管壁上，盡快蓋緊管蓋。上機(jī)前注意檢查各反應(yīng)管是否蓋緊，以免熒光物質(zhì)泄露污染儀器。16.9并與廢物一起滅菌后方可丟棄。10 , 丟棄于指定地點(diǎn)。11 10次氯酸鈉的廢物缸內(nèi)，