膠回收注意事項(xiàng)以及感受態(tài)細(xì)胞的制作

1、膠回收DNA注意事項(xiàng)切膠回收DNA片段是要把整個(gè)目的片斷所在位置的膠全部回收。所以為了減少膠的體積， 我們 就可以用相對比較薄的膠來跑電泳，通常只要夠點(diǎn)樣即可，或是采用薄而寬的梳子來 跑膠。這樣可減少回收試劑引起的一些后續(xù)麻煩。主要還是DNA的濃度，如果DNA濃度不夠，想膠小點(diǎn)也不可能。紫外燈下切下含待回收DNA的凝膠時(shí)，要襯以干凈的塑料薄膜，使用無DNA污染的新 刀片，其目的在于防止外源DNA的污染。利用凝膠回收試劑盒DNA回收效率較低或者未回收到目的片段可能有以下幾個(gè)原因：膠 塊未完全溶解，可適當(dāng)延長水浴時(shí)間，并增加上下顛倒次數(shù)輔助溶解；膠塊體積太大，應(yīng) 先將其切為小塊，分多次回收；電泳緩

2、沖液pH太高，硅基質(zhì)膜在高鹽低pH結(jié)合DNA， 如pH太高，應(yīng)作適當(dāng)調(diào)整；漂洗液中未加入無水乙醇?？梢愿挠萌ルx子水洗脫。但是實(shí)驗(yàn)室所用純水一般pH偏低，可利用NaOH適當(dāng)調(diào)高其 pH值，以增加洗脫得率。洗脫產(chǎn)物含有殘留的乙醇會影響后續(xù)酶切實(shí)驗(yàn)，請確保徹底去除漂洗緩沖液，具體方法參 見回收效率低的解決方案。不可以使用更小洗脫體積（小于說明書提供的最小洗脫體積）進(jìn)行洗脫以提高濃度，因?yàn)?說明書提供的最少洗脫體積是能完全覆蓋吸附膜的最小體積，若減少體積則不能將DNA 完全洗脫下來。電泳檢測只有一條目的帶，可以選用凝膠回收試劑盒。如果后續(xù)實(shí)驗(yàn)對片段純度要求較高， 建議即使只有一條帶，也可以切膠純化，其

3、回收得到片段的純度可能要比直接回收高一些。瓊脂糖凝膠膠塊不溶可能是下述原因：瓊脂糖質(zhì)量不好；含目的片段的凝膠再空氣中放置 過久，使膠塊失水、干燥，建議切膠后立即進(jìn)行回收或?qū)⒛z塊保存在4C或-20C ；制膠的 電泳緩沖液濃度過高或陳舊。關(guān)于膠回收切膠的一點(diǎn)注意事項(xiàng)電泳的buffer和gel都是新制的，切膠的臺子清理干凈，刀片最好洗凈滅菌，總之一句話 就是保證切下的帶沒有外源dna污染。切膠是要把整個(gè)目的片斷所在位置的膠全部回收。為了減少膠的體積，可以用相對比較 薄的膠來做，只要夠點(diǎn)樣即可，也可采用薄而寬的梳子來跑膠。關(guān)于防護(hù)，在一般有機(jī)玻璃后就足夠了，戴上防護(hù)面具以保護(hù)眼睛，如果戴樹脂眼鏡就 可

4、以了。要是非常害怕紫外照射，或者對于膠有特殊要求，例如要求不含EB,可以采用點(diǎn) marker和帶刻度的尺子一起照相的方法來確定目的條帶在膠上的位置進(jìn)行切膠。4.按照正常程序點(diǎn)marker跑膠，然后切下有marker的膠，EB染色，紫外燈下與帶刻度的 尺子一起照相。由于要回收的帶與marker間的相對位置已矢口，根據(jù)尺子來衡量未染色膠上 目的帶的位置即可。如果覺得很難判斷，可以直接在marker邊點(diǎn)少量的樣，這樣位置就容 易確定了。提高膠回收量的辦法1）增加電泳時(shí)的上樣量。2）電泳緩沖液用新鮮配制的。3）切膠時(shí)盡量只切有條帶的膠，減小切膠體積：含目的片斷很少的膠就不要要了，不然影 響回收率。4）

5、把切的兩塊或多塊膠融化后，無論多大的體積都用一個(gè)管子，轉(zhuǎn)移到同一個(gè)柱子上。5）溶膠時(shí)所加的溶液可多一點(diǎn)，這樣更有利于DNA與膜的結(jié)合，不過一般不要多余750ul。6）膠回收的關(guān)鍵是通過柱子的溶液的鹽濃度、酸堿性（電荷）和疏水性使DNA與柱子結(jié)合， 因此，若電泳緩沖液的PH偏高，可在溶膠液中加入10ul（PH 5.0，3mol/L的NaAC）；為 了使DNA分子更好的攔截在膜上，可以添加30%異丙醇在加熱溶解膠后的液體里。7）加洗脫液之前，將柱子在室溫放置幾分鐘（大約需10分鐘），以使乙醇充分揮發(fā)。8）最后少加些洗脫液，盡量減少回收體積，一般用30-50洗脫液洗脫（不能太少，否則無 法浸濕膜反而

6、不利于洗脫）；洗脫液滴在膜中央，以充分洗脫結(jié)合在膜上的DNA。9）可以在加入洗脫液之后，可以在55度水浴5分鐘或放在50度水浴10分鐘以上再洗脫， 或用封口膜密封4度過夜，第二天再離心回收，效果不錯(cuò)。10）將離心后的洗脫液加回吸附柱，再次離心。幾種PCR產(chǎn)物回收的詳方法和步驟1）普通膠回收如果要膠回收，最好還是用試劑盒，方便，回收率也略高，實(shí)在要手工回收，可以切膠 后加入3倍體積TE，水浴熔化后，酚、酚氯仿抽提干凈，乙醇沉淀即可。另外好像還有冷 凍法，沒作過，不是很清楚。2）從低熔點(diǎn)凝膠回收DNA純化 DNA 片段 加與凝膠體積相等的 TE（ 10mmol/l Tris-HCl pH8.0,0

7、.1mmol/l EDTA），置65C水浴5分鐘保溫，使凝膠完全溶解。待放至室溫，加等量酚（TE飽和，TE封在上 層，取下層酚），輕輕混勻（不用混勻），12000rpm, 3分鐘離心。反復(fù)1-2次。取上層液， 加0.1體積3mol/L醋酸鈉（pH5.2）和2.5倍體積無水乙醇，進(jìn)行乙醇沉淀。將純化的DNA 加適量TE溶解，測定含量，備用（可用于目的基因結(jié)構(gòu)分析，探針制備等）。3）擴(kuò)增特異性好的PCR回收如果PCR擴(kuò)增特異性好，只是簡單的PCR產(chǎn)物純化回收，可以在PCR產(chǎn)物中加入 50ug/ml的蛋白酶K，37度1h，酚/氯仿抽提一次，氯仿抽提一次，上清加入0.1體積的醋 酸鈉，2.5體積的無水

8、乙醇沉淀回收。不需膠回收就可直接連接的方法1）低溫冷凍析出法跑電泳時(shí)用低熔點(diǎn)的agarose膠，跑到一定時(shí)候，將目的條帶所在的那一段膠切下，盡 量切干凈，讓核酸直接暴露在膠的表面，并且，把底下沒有脫氧核酸的那點(diǎn)膠也盡量切掉， 然后放入1.5ml EP管中，然后放在負(fù)75度冰箱中10-30分鐘，接著1，300rpm離心5 一 10分鐘，取10ul上清，加入連接體系中。將其余的液體也吸出，儲存在另一個(gè)管子中，做 好標(biāo)記，放在一20度備用。2）酶切后的直接連接在你酶切后可以直接的加入連接酶和另外的片斷進(jìn)行連接是可以篩選出連接好的片斷的。四、一些注意事項(xiàng)電泳的buffer和gel都是新制的，切膠的臺子

9、清理干凈，刀片最好洗凈滅菌，總之一句話 就是保證切下的帶沒有外源DNA污染。切膠是要把整個(gè)目的片斷所在位置的膠全部回收。為了減少膠的體積，可以用相對比較 薄的膠來做，只要夠點(diǎn)樣即可，也可采用薄而寬的梳子來跑膠。關(guān)于防護(hù)，在一般有機(jī)玻璃后就足夠了，戴上防護(hù)面具以保護(hù)眼睛，如果你戴樹脂眼鏡 就可以了。瓊脂糖對回收率有一定影響，如果瓊脂糖較多，可以增加溶膠液，保證體系鹽濃度。影 響回收率的因素主要是柱子填料必須在適宜的緩沖環(huán)境中（如果用柱子的話）。對于小于1 OObp的片段回收，可加至30%異丙醇。如果是用PAGE回收，用水或TE溶解，槍頭搗碎，過夜浸泡，即可。當(dāng)然你要將100bp 在膠中位置定好切

10、下。已標(biāo)記的探針用X片，未標(biāo)記的用EB。選用回收效率較高的柱子，比如進(jìn)口的Qiaquick spin columno參照分子克隆用低熔點(diǎn)膠回收。除低熔點(diǎn)凝膠回收法外，如用一般凝膠可用透析帶短暫 電泳，離心管低部加玻璃棉，高速離心等方法回收DNA片段。附注：影響DNA在瓊脂糖凝膠中遷移速率的因素：1）DNA分子大小遷移速率U與logN成反比（N為堿基對數(shù)目）。分子大小相等，電荷基 本相等（DNA結(jié)構(gòu)重復(fù)性）。分子越大，遷移越慢。等量的空間結(jié)構(gòu)緊密的電泳快（超螺旋 線性DNA）2）瓊脂糖濃度：logU=logU0 Krt膠濃度，U為遷移率，U0為DNA的自由電泳遷移率，t 為膠濃度，Kr為介質(zhì)阻滯

11、系數(shù)。不同的凝膠濃度，分辨不同范圍的DNAAgarose： 0.5%： 1-30 kb； 0.7%： 0.8-12 kb1.2%： 0.4-7 kb； 1.5%： 0.2-3 kb.3）DNA構(gòu)象：一般遷移速率超螺旋環(huán)狀線狀DNA單鏈開環(huán)。當(dāng)條件變化時(shí)，情況會相反， 還與瓊脂糖的濃度、電流強(qiáng)度、離子強(qiáng)度及EB含量有關(guān)。4）所加電壓：低電壓時(shí)，線狀DNA片段的遷移速率與所加電壓成正比。使分辨效果好，凝 膠上所加電壓不應(yīng)超過5V/cm5）堿基組成與溫度：一般影響不大4-30 C6）嵌入染料的存在：降低線性DNA遷移率，（不提倡加在電泳液中）7）電泳緩沖液（0.5XTBE）的組成及其離子強(qiáng)度影響DN

12、A的遷移率，無離子存在時(shí)，核 酸基本不泳動，離子強(qiáng)度過大產(chǎn)熱厲害，熔化凝膠并導(dǎo)致DNA變性，一般采用1XTAE， 1xTBE，1XTPE （均含 EDTA pH8.0）。漠化乙錠（EB）為致癌劑，操作時(shí)應(yīng)戴手套，盡量減少臺面污染。電泳指示劑：核酸電泳常用的指示劑有兩種，漠酚藍(lán)bromophenol blue, Bb）呈藍(lán)紫色; 二甲苯晴（xylene cyanol, Xc）呈藍(lán)色，它攜帶的電荷量比漠酚藍(lán)少，在凝膠中的的遷移率 比漠酚藍(lán)慢。二、實(shí)驗(yàn)原理首先利用低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠電泳DNA片段，分離目的條帶DNA，然后紫外光下切割 含目的DNA條帶的膠塊，利用膠回收試劑盒回收純化DNA片段。試劑盒的

13、膠回收柱采用 特殊硅基質(zhì)材料在一定的高鹽緩沖系統(tǒng)下高效、專一地吸附DNA、RNA的原理，配備設(shè)計(jì) 獨(dú)特的離心吸附柱式結(jié)構(gòu)，使用常規(guī)臺式高速離心機(jī)，在幾分鐘之內(nèi)即可以高效回收核酸片 段。儀器與試劑1、瓊脂糖凝膠電泳系統(tǒng)2、紫外觀察分析儀3、離心機(jī)4、單面刀片5、恒溫水浴鍋?zhàn)⒁馐马?xiàng)：-切膠時(shí)應(yīng)快速操作，在紫外燈下時(shí)間長容易傷害到眼睛；-漠化乙錠染色后的DNA易受紫外光破壞，故盡量放置于暗室，切帶時(shí)應(yīng)使用長波 長紫外燈，切膠時(shí)間盡量短。-膠塊一定要充分融化，否則將會嚴(yán)重影響DNA的回收率。-把洗脫液加熱，使用時(shí)有利于提高洗脫液效率?；厥债a(chǎn)物質(zhì)量：回收產(chǎn)物的質(zhì)量主要指純度。常規(guī)電泳過程中，普通級別的瓊

14、脂糖 自帶的一些性狀不明的多糖，會連同DNA 一起從凝膠中抽提出來，會強(qiáng)烈抑制后繼的 連接、酶切、或者標(biāo)記、擴(kuò)增等實(shí)驗(yàn)。從凝膠中回收DNA片斷，產(chǎn)物的純度自然是 我們考慮的第一要務(wù)。對于大片斷DNA回收，質(zhì)量還包括了產(chǎn)物的完整與否，如果機(jī) 械剪切力使得回收產(chǎn)物大小不一致，后果決不是你希望碰見的。而對于較小片斷回收，質(zhì) 量其實(shí)還包括了回收產(chǎn)物的濃度。因?yàn)楫a(chǎn)物濃度太小，對后繼實(shí)驗(yàn)同樣也有影響，比如連接、 標(biāo)記實(shí)驗(yàn)等等就很不爽，往往不得不再濃縮一次，增加了操作的復(fù)雜性。此外，極微量的 純化介質(zhì)或者是某些試劑混入回收產(chǎn)物中也會對結(jié)果產(chǎn)生致命的影響?；厥章剩夯厥盏寐?，是我們考慮的另一個(gè)重要參數(shù)。由于上電

15、泳的樣品量通常都很少， 電泳的過程本身也會導(dǎo)致樣品的分散和損失，因而盡可能多的回收電泳凝膠條帶中的目的 片斷，提高產(chǎn)物得率，對于后繼實(shí)驗(yàn)來說是非常重要的?；厥章实亩嗌偻ǔ：突厥债a(chǎn)物 的大小以及量的多少有關(guān)，比如DNA片斷越大，和固相基質(zhì)的結(jié)合力越強(qiáng)，就越難洗 脫，回收率就低；又比如說，DNA的量越少，相對損失越大，回收率越低。因此，根 據(jù)情況選擇不同的方法是很重要的。值得注意的是，由于樣品的大小和多少對回收率都有 顯著的影響，所以回收率并非是一成不變的。雖然是幾乎不需要實(shí)驗(yàn)技巧的簡單操作，如 果你注意到一些小技巧還是很有幫助的。DNA回收純度取決于純化介質(zhì)對DNA吸附的 特異性、洗滌雜質(zhì)是否徹

16、底。而DNA回收率和濃度則與elution buffer的體積，以及buffer 在柱子上停留的時(shí)間有關(guān)。較大的洗脫體積可以提高回收率，充分洗脫，但是會造成產(chǎn) 物濃度太低不好用。一、實(shí)驗(yàn)原理大腸桿菌經(jīng)過處理后可以攝取外源DNA（Plasmid DNA、Phage DNA等），處于這 種狀態(tài)的細(xì)胞稱為感受態(tài)細(xì)胞（Competent Cell）。在基因工程實(shí)驗(yàn)中，經(jīng)常要使用各種感受 態(tài)細(xì)胞進(jìn)行DNA的轉(zhuǎn)化操作。實(shí)驗(yàn)使用的感受態(tài)細(xì)胞的來源大體可以分為兩種：一種是 購買商品化的感受態(tài)細(xì)胞，但商品化感受態(tài)細(xì)胞成本高、運(yùn)輸及保存有一定困難（超低溫）； 另一種是自己制備感受態(tài)細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)人員自己制作感受態(tài)細(xì)胞

17、時(shí)，往往受到各種試劑及實(shí)驗(yàn) 條件等限制，制備的感受態(tài)細(xì)胞效率低，達(dá)不到實(shí)驗(yàn)要求。目前，感受態(tài)細(xì)胞的制備常用冰 預(yù)冷的CaCl2處理細(xì)菌的方法制備，即用低滲CaCl2溶液在低溫（0C ）時(shí)處理快速生長的 細(xì)菌，從而獲得感受態(tài)細(xì)菌。此時(shí)細(xì)菌膨脹成球形，外源DNA分子在此條件下易形成抗 DNA酶的羥基一鈣磷酸復(fù)合物粘附在細(xì)菌表面，通過熱激作用促進(jìn)細(xì)胞對DNA的吸收。 在一定條件下，經(jīng)過連接后的DNA片段與感受態(tài)細(xì)胞混合保溫，可以進(jìn)入感受態(tài)細(xì)胞。進(jìn) 入感受態(tài)細(xì)胞的DNA分子通過復(fù)制、表達(dá)，實(shí)現(xiàn)遺傳信息的轉(zhuǎn)移，使受體細(xì)胞出現(xiàn)新的遺 傳性狀。將經(jīng)過轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞在選擇性培養(yǎng)基中培養(yǎng)，即可篩選出轉(zhuǎn)化體，即帶有

18、異源DNA 分子的受體細(xì)胞。二、實(shí)驗(yàn)所需器材和試劑器材：恒溫?fù)u床，電熱恒溫培養(yǎng)箱，臺式高速離心機(jī)，無菌工作臺，低溫冰箱，恒溫水浴 鍋，制冰機(jī)，分光光度計(jì)，微量移液槍。試劑：LB固體和液體培養(yǎng)基。含特定抗生素的LB固體培養(yǎng)基。3.100mM CaCl2 溶液。含15%甘油的0.05mol/L CaCl2:稱取0.28g CaCl2（無水，分析純），溶于50ml重蒸水中， 加入15ml甘油，定容至100ml，高壓滅菌。待轉(zhuǎn)化質(zhì)粒。四、實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)制作感受態(tài)細(xì)胞時(shí)應(yīng)使用專用的玻璃器皿或塑料容器。洗刷這些玻璃器皿或塑料容器時(shí) 應(yīng)盡量洗凈。由于微量的洗滌劑或污染物都可能降低感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化效率，因此在洗

19、刷 完用于制作感受態(tài)細(xì)胞的專用玻璃器皿或塑料容器后，最好用去離子水浸泡一晚，然后再充 分洗凈。制作感受態(tài)細(xì)胞時(shí)使用的菌種，不應(yīng)使用4C或常溫保存的傳代細(xì)菌。應(yīng)使用-70C保存 的菌種，在LB/抗生素平板培養(yǎng)基上分級劃線培養(yǎng)后，挑取單菌落。使用這種菌種制作的 感受態(tài)細(xì)胞，能提高轉(zhuǎn)化效率。培養(yǎng)感受態(tài)細(xì)胞制備用菌體時(shí)，OD 600值的測定應(yīng)隨時(shí)進(jìn)行，以使OD 600值控制在 0.350.5之間。如果OD 600值超出此范圍，可能降低感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化效率。用于感受態(tài)細(xì)胞制備的菌體培養(yǎng)停止后要立即處理，不要將培養(yǎng)液過長時(shí)間室溫放置， 在冰中放置時(shí)也不要時(shí)間過長。感受態(tài)細(xì)胞的制備操作過程中，離心后棄上清時(shí)

20、要盡量棄盡，否則會降低感受態(tài)細(xì)胞的 轉(zhuǎn)化效率。使用Solution A、Solution B懸浮沉淀時(shí)要用手指輕輕彈動Microtube管壁，禁止劇烈震 蕩操作。為了有效確認(rèn)感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化效率，最好制作一批高純度的質(zhì)粒DNA分裝低溫 （-20C ）保存，用作陽性對照，以確認(rèn)每批制作的感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化效率。感受態(tài)細(xì)胞的制備方法菌種純化使用LB/抗生素平板培養(yǎng)基（根據(jù)菌種性質(zhì)加入適當(dāng)?shù)目股兀媒臃N針挑取大腸桿菌 （-70C甘油保存菌），在平板培養(yǎng)基上分級劃線，以能夠出現(xiàn)單菌落為宜。將上述劃線的平板培養(yǎng)基倒置于恒溫培養(yǎng)箱中37C過夜培養(yǎng)。菌體培養(yǎng)取20 ml tpbxbr移至 100 ml三角燒瓶中，塞上棉塞后高溫高壓滅菌，然后冷卻至室溫。在劃線平板培養(yǎng)基上挑取單菌落，接種到的培養(yǎng)基中。37 C振蕩（約120 rpm）培養(yǎng)。測定OD 600值，當(dāng)OD 600值達(dá)到0.350.5時(shí)（約培養(yǎng)5小時(shí)）放置冰中停止培養(yǎng)（如 果OD 600值超出此范圍將不能保證感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化效率）。進(jìn)行下一步操作。感受態(tài)細(xì)胞的制備取上述菌體培養(yǎng)液1 ml于1.5 ml Microtube中（根據(jù)需要量確定Microtube數(shù)量）1, 500 xg （一般的微型離心機(jī)約4, 000 rpm） 4。離心5分鐘，棄上清（注意盡量除盡 上清）在每個(gè)Microtube中加入100 pl