血紅蛋白的提取和分離

1、精品文檔血紅蛋白的提取和分離【學(xué)習(xí)目標(biāo)】.熟記凝膠色譜法、電泳法分離生物大分子的基本原理，了解緩沖液的組成及其作 用；.掌握血紅蛋白的提取與分離的基本過程和方法。思考1:分離生物大分子的基本思路是什么？選用一定的物理或化學(xué)的方法分離具有不同物理或化學(xué)性質(zhì)的生物大分子。思考2:蛋白質(zhì)的分離和提取的原理是什么？根據(jù)蛋白質(zhì)各種特性的差異，如分子的 、所帶電荷的 、溶解度 和 的性質(zhì)和對其他分子的 等等，可以用來分離不同蛋白質(zhì)。一、基礎(chǔ)知識：凝膠色譜法(又稱分配色譜法)：1、概念：根據(jù)被分離蛋白質(zhì)的 ,利用具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠的分子篩作用， 來分離蛋白質(zhì)的有效方法。2、凝膠：實(shí)際上是一些微小的 ,這些小

2、球體大多數(shù)是由 構(gòu)成的， 如 和,內(nèi)部有許多貫穿的通道。3、原理：當(dāng)不同的蛋白質(zhì)通過凝膠時，相對 的蛋白質(zhì)容易進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道，路程,移動,而 的蛋白質(zhì) 進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道，只能在 移動，路程,移動速度 ,相對分子質(zhì)量不 同的蛋白質(zhì)因此得以分離。4、具體過程：多孑板多孑板A.的蛋白質(zhì)由于 作用進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部而被滯留； 的 蛋白質(zhì)被排阻在凝膠顆粒外面，在顆粒之間迅速通過。(1) 混合物上柱；(2)洗脫開始， 的蛋白質(zhì)擴(kuò)散進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)； 的 蛋白質(zhì)被排阻于凝膠顆粒之外；(洗脫：從色譜柱上端不斷注入緩沖液，促使蛋白質(zhì)分子的差速流動)的蛋白質(zhì)被滯留； 的蛋白質(zhì)被向下移動。不同的蛋白質(zhì)分子完全分開

3、；的蛋白質(zhì)行程較短，已從 中洗脫出來，的 蛋白質(zhì)還在行進(jìn)中。1歡在下載精品文檔緩沖溶液：1、作用：在一定范圍內(nèi)，能夠抵制 的對溶液的 的影響,維持PH基本不變。2、緩沖溶液的配制通常由 種緩沖劑溶解于水中配制而成。調(diào)節(jié)緩沖劑的 就可以制得 使用 的緩沖液。思考3:本課題中使用的緩沖液是什么？它的目的是什么？使用的是pH=的,目的是利用緩沖液模擬細(xì)胞內(nèi)pH環(huán)境，保證血紅蛋白的正常 和。電泳：1、概念：指 在 的作用下發(fā)生 的過程。2、原理： a、許多重要的生物大分子，如核酸多肽等都具有 ,在 下，這些基團(tuán)會帶上 或 。b、在電場的作用下，這些帶電分子會向著與其所帶電荷 的電極移動。c、電泳利用了

4、待分離樣品中各種分子 以及分子本身 、的不同 使帶電分子產(chǎn)生不同的 ,從而實(shí)現(xiàn)樣品中各種分子的分離。3、常用方法：f瓊脂糖凝膠電泳L聚丙稀酰胺凝膠電泳。SDS 聚丙稀酰胺凝膠電泳加入待分離的帶電性質(zhì)、分子大小和形狀的 不同，使分子遷移速度不同凝膠電泳原理示意圖測定蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量通常用十二烷基硫酸鈉（ 蛋白質(zhì)在聚丙烯酰胺凝膠中的遷移率取決于 它所帶靜電荷的多少以及分子的大小等因素。SDS 聚丙稀酰胺凝膠電泳加入待分離的帶電性質(zhì)、分子大小和形狀的 不同，使分子遷移速度不同凝膠電泳原理示意圖為了消除靜電荷對遷移率的影響可以在 凝膠中加入 。SDS能使蛋白質(zhì)發(fā)生完 全變性。由幾條肽鏈組成的蛋白質(zhì)復(fù)

5、合體在 SDS的作用下會解聚成單條肽鏈，因此測定的 結(jié)果只是 。SDS能與 各種蛋白質(zhì)形成蛋白質(zhì)一SDS復(fù)合物，SDS所 帶負(fù)電荷的量大大超過了蛋白質(zhì)分子原有電 荷量。因而掩蓋了不同種蛋白質(zhì)間的電荷差 別，使電泳遷移率完全取決使用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳測定蛋白質(zhì)的分子量時，可選用一組已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白同時進(jìn)行電泳， 根據(jù)已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白的電泳區(qū)帶位置，可以測定未知蛋白質(zhì)的分子量。市場上有高分子量、次高分子量及低分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白試劑出售。二、實(shí)驗(yàn)操作蛋白質(zhì)的提取和分離一般分為四步：樣品處理一一粗分離一一純化一一純度鑒定（一）樣品處理a、血液由 和 組成，其中 最多。b、在紅細(xì)胞的組成中

6、，約90%是血紅蛋白。血紅蛋白由 一個肽鏈組成，包括 和。其中每條肽鏈環(huán)繞著一個 ，此基團(tuán)可攜帶 或 。血紅蛋白因含有 而 呈現(xiàn)紅色。本課題可選用豬、牛、羊或其他脊椎動物的血液來分離血紅蛋白。2歡在下載精品文檔思考4:你認(rèn)為鳥類血液和哺乳動物血液中，最好哪種血液來提取血紅蛋白？為什么？ 哺乳動物血液，因?yàn)樵摷?xì)胞中沒有 ,血紅蛋白含量高。(1)紅細(xì)胞的洗滌目的：去除 ,以得于后續(xù)步驟的分離純化。方法：按每100ml血液加入3g檸檬酸鈉的比例向采血容器中預(yù)先加入檸檬酸鈉，采集的 血樣 離心，然后用膠頭吸管吸出上層透明的 ,將下層的倒入燒杯再加入用 的,緩慢，低速短時間 , 如此重復(fù)次，直至上清液中

7、已沒有，表明洗滌干凈。受黃色血炭|f一出恤樣低速短時間離心|毀暗紅色紅細(xì)胞加入五倍休稅的生處 4_ i純凈紅和-再低速時間離工：注意：洗滌次數(shù)，離心速度與離心時間十分重要。洗滌次數(shù)過少，；離心速度過高和時間過長會使 ,達(dá)不到分離的效果。思考5:加入檸檬酸鈉有何目的？為什么要低速、短時離心？為什么要緩慢攪拌？能否用 蒸儲水代替生理鹽水？防止血液 ;防止白細(xì)胞沉淀；防止紅細(xì)胞破裂釋放出血紅蛋白；不能，生理鹽水能保持紅細(xì)胞的 穩(wěn)定而不至于破裂，在未洗凈血漿中的雜蛋白 前，紅細(xì)胞如果提前破裂， 就可能使血紅蛋白與雜質(zhì)血漿蛋白混在一起，加大了分離的難度。(2)血紅蛋白的釋放 目的：使紅細(xì)胞破裂，釋放 。

8、方法：將洗滌好的紅細(xì)胞倒入燒杯中，加 到 體 積，再加40%體積的 ,置于 上充分?jǐn)嚢?0分鐘，在蒸儲紅細(xì)胞水和甲苯的作用下，紅細(xì)胞破裂釋放出血紅蛋白。紅細(xì)胞)一到原血液體積班需水十班需水45%體積的小基思考6:加入的蒸儲水、甲苯的作用分別是什么？充分?jǐn)嚢璧哪康氖鞘裁?蒸儲水的作用：使紅細(xì)胞 ;甲苯的作用：溶解紅細(xì)胞的；充分?jǐn)嚢璧哪康模杭铀偌t細(xì)胞的 。(3)分離血紅蛋白溶液：3歡在下載精品文檔將攪拌好混合液轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)，以2000r/min的速度離心10 min ,試管中的溶液分為4層:第精品文檔將攪拌好混合液轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)，以2000r/min的速度離心10 min ,試管中的溶液分為4層

9、:第1層第2層第3層第4層（最上層）（中上層）（中下層）（最下層）其它雜質(zhì)甲苯層的沉淀層，的水溶液層，_ 的沉淀層色薄層固體的液體將試管中的液體用濾紙過濾，除去,于分液漏斗中靜置片刻后，分出下層的（二）粗分離一一透析（1）目的：透析可以去除樣品中 的雜質(zhì)，或用于更換樣品的緩沖液。（2）原理：透析袋能使 自由進(jìn)出，而 大分子保留在袋內(nèi)。透析袋：一般是用 硝酸纖維素（又稱玻璃紙）制成的。（3）操作：取1ml的血紅蛋白溶液裝入透析袋中，將透析袋放入盛有300ml物質(zhì)的量濃度為 20mmol/L 的, （ pH 為）,透析。（三）純化一一凝膠色譜操作1）凝膠色譜柱的制作 取長40厘米，內(nèi)徑1.6厘米的

10、玻璃管，兩端需用砂紙磨平。底塞的制作：橡皮塞打孔一挖出凹穴一安裝移液管頭部一覆蓋尼龍網(wǎng)，再用100目尼龍紗包好，插到玻璃管的一端。注意事項(xiàng)：底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，否則難以鋪實(shí)尼龍網(wǎng)，還會導(dǎo)致液體殘留，蛋白質(zhì)分離不徹底。頂塞的制作：打孔一安裝玻璃管。組裝：將上述三者按相應(yīng)位置組裝成一個整體，并在下端出口連接帶開關(guān)的尼龍管，尼龍管放入收集器。安裝其他附屬結(jié)構(gòu)。2）凝膠色譜柱填料的處理（1）凝膠的選擇：，4歡在下載精品文檔(2)方法：配置凝膠懸浮液：計算并稱取一定量的凝膠浸泡于 中充分溶脹后，配成 注意：商品凝膠是干燥的顆粒，使用前需直接放在 中膨脹。為了加速膨脹，可以將

11、加入洗脫液的濕凝膠用 加熱，逐漸升溫至接近沸騰，通常只需 。這種方法不 但節(jié)約時間，而且可以除去凝膠中可能帶有的 ,排除膠粒內(nèi)的 。(3)凝膠色譜柱的裝填方法固定：將色譜柱處置固定在支架上裝填：將 一次性的緩慢倒入 內(nèi)，裝填時輕輕敲動色譜柱， 使凝膠填裝均勻。注意：在色譜柱中裝填凝膠的時候要盡量緊密，以降低 。在裝填凝膠柱時， 不得有 存在，一旦發(fā)現(xiàn)有 ,必須重裝。氣泡會攪亂洗脫液中蛋白質(zhì)的 , 降低分離效果。在凝膠色譜操作過程中，不能發(fā)生 , 的現(xiàn)象。一旦 發(fā)生這種情況，凝膠色譜柱需要 。洗滌平衡裝填完畢后，立即用緩沖液洗脫瓶， 在 高的操作壓下，用300ml的20mmol/l的磷酸緩沖液(

12、pH為7.0 )充分 12 小時，使凝膠裝填緊密。3)樣品加入與洗脫(1)加樣前：打開下端流出口， 使柱內(nèi)凝膠面上的 緩慢下降到與 平 齊，關(guān)閉出口(2)加透析樣品調(diào)整緩沖液面：與 平齊滴加透析樣品：用吸管將1ml的樣品加到 ,滴加樣品時，吸管管口貼著管壁環(huán) 繞移動加樣，同時注意 。樣品滲入凝膠床：加樣后打開下端出口，使樣品滲入凝膠床內(nèi)，等樣品 后， 關(guān)閉下端出口。洗脫：小心加入 pH= 7.0的20mmol/l的 到適當(dāng)高度，連接緩沖液洗脫瓶，打開下端出口進(jìn)行洗脫。收集：待 接近色譜柱底端時， 用試管收集流出液， 每 收集一試管連續(xù)收集。注意：在蛋白質(zhì)分離過程中， 仔細(xì)觀察 在洗脫過程中的移

13、動情況。 如果 均勻一致的移動，說明色譜柱制作成功。思考7:血紅蛋白呈現(xiàn)紅色，這一特點(diǎn)對進(jìn)行蛋白質(zhì)的分離有什么意義？血紅蛋白是有色蛋白，因此在凝膠色譜分離時可以通過觀察 來判斷什么時候應(yīng)該收集 洗脫液。這使血紅蛋白的分離過程非常直觀，大大簡化了實(shí)驗(yàn)操作。4.純度鑒定SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳判斷 的蛋白質(zhì)是否達(dá)到要求，需要進(jìn)行蛋白質(zhì)純度的鑒定。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定血紅蛋白純度電泳方法步驟根據(jù)廠家說明書安裝電泳用的玻璃板一 SDS-聚丙烯酰胺凝膠制備一樣品處理一 把凝膠固定于電泳裝置上 一加樣：按順序加樣，加樣量通常為10 25 L一電泳一剝膠一 染色脫色觀察結(jié)果三、結(jié)果分析與評價5歡

14、在下載精品文檔(1)對血液樣品處理后發(fā)生的變化正常現(xiàn)象：由于血紅蛋白與氧氣結(jié)合呈鮮紅色，與二氧化碳結(jié)合呈暗紅色，所以剛分離的血紅蛋白溶液呈紅色。觀察你處理的血液樣品離心后是否分層，如果分層不明顯，可能是洗滌次數(shù)少、未能除去血漿蛋白的原因。此外，離心速度過高和時間過長，會使白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞一同沉淀，也得不到純凈的紅細(xì)胞，影響后續(xù)血紅蛋白的提取純度。(2)判斷裝填的凝膠色譜柱是否成功判斷方法：a、由于凝膠是一種半透明的介質(zhì)，因此可以在凝膠柱旁放一支與凝膠柱垂直的日光燈，檢 查凝膠是否裝填得均勻。b、此外，還可以加入大分子的有色物質(zhì)，例如藍(lán)色葡聚糖一2000或紅色葡聚糖，觀察色帶移動的情況。如果色帶

15、均勻、狹窄、平整，說明凝膠色譜柱的性能良好。調(diào)整方法：如果色譜柱出現(xiàn)紋路或是氣泡，輕輕敲打柱體以消除氣泡，消除不了時要重新裝柱。(3)對分離效果的判斷如果凝膠色譜柱裝填得很成功、分離操作也正確的話，能清楚地看到血紅蛋白的紅色區(qū)帶均勻、狹窄、平整，隨著洗脫液緩慢流出；如果紅色區(qū)帶歪曲、散亂、變寬，說明分離的效果不好，這與凝膠色譜柱的裝填有關(guān)。四、課后練習(xí)1、下面是凝膠色譜法分離血紅蛋白時樣品的加入(圖I)和洗脫(圖n)示意圖，請據(jù)圖 回答下列問題。(1)在加樣示意圖中，正確的加樣順序是 。mL收集一管，連(2)用吸管加樣時，應(yīng)注意正確操作，分別是 mL收集一管，連(3)等樣品 時，才加入緩沖液。

16、(4)待 接近色譜柱底端時，用試管收集流出液，每6歡立下載精品文檔續(xù)收集。答案：(1)一一一(2)不要觸及破壞凝膠面貼著管壁加樣使吸管管口沿管壁環(huán)繞移動(3)完全進(jìn)入凝膠層(4)紅色的蛋白質(zhì) 52、血紅蛋白是人和其他脊椎動物紅細(xì)胞的主要組成成分，負(fù)責(zé)血液中O2 CO2的運(yùn)輸。請根據(jù)血紅蛋白的提取和分離流程圖回答問題。(1)將實(shí)驗(yàn)流程補(bǔ)充完整： A為, B為。凝膠色譜法的基本原理是根據(jù) 來分離不同種類的蛋白質(zhì)。(2)洗滌紅細(xì)胞的目的是去除 ,洗滌次數(shù)過少，無法去除去 ;離心速 度和時間過長會使一同沉淀，達(dá)不到分離的效果。洗滌干凈的標(biāo)志是。釋放血紅蛋白的過程中起作用的是 。(3)透析的作用是。(4

17、)在洗脫過程中加入物質(zhì)的量濃度為20mmol/L的磷酸鹽緩沖液(pH為7.0)的目的是。如果紅色區(qū)帶 ,說明色譜柱制作成功。答案：(1)血紅蛋白的釋放樣品的加入和洗脫相對分子質(zhì)量的大小(2)去除雜蛋白，利于后續(xù)步驟的純化血漿蛋白 白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞上清液中沒有黃色蒸儲水和甲(3)去除小分子雜質(zhì)(4)準(zhǔn)確模擬生物體內(nèi)的生理環(huán)境，保持體外的pH和體內(nèi)一臻均勻一致的移動3?凝膠色譜技術(shù)是六十年代初發(fā)展起來的一種快速而又簡單的分離技術(shù)，由于設(shè)備簡單、操作方便，不需要有機(jī)溶劑，對高分子物質(zhì)有很高的分離效果，目前已經(jīng)被生物化學(xué)、分子生物學(xué)、生物工程學(xué)、分子免疫學(xué)以及醫(yī)學(xué)等有關(guān)領(lǐng)域廣泛應(yīng)用，不但應(yīng)用于科學(xué)實(shí)驗(yàn)研究，而且已經(jīng)大規(guī)模地用于工業(yè)生產(chǎn)。據(jù)下圖回答問題：7歡在下載精品文檔(1)a、b均為蛋白質(zhì)分子，其中先從層析柱中洗脫出來的是 ,原因是(2)自己制作凝膠色譜柱