實(shí)驗(yàn)八 熒光光光度法測(cè)定核黃素的含量

1、實(shí)驗(yàn)八熒光光度法測(cè)定核黃素的含量 實(shí)驗(yàn)八熒光光度法測(cè)定核黃素的含量（見教材p118）實(shí)驗(yàn)?zāi)康牧私鉄晒夥y(cè)定核黃素的原理和方法；學(xué)習(xí)熒光光度計(jì)的操作和使用。實(shí)驗(yàn)原理某些具有n-n電子共軛體系的分子易吸收某一波段的紫外光而被激發(fā)，如該物質(zhì)具有較高的熒光效率，則會(huì)以熒光的形式釋放出吸收的一部分能量而回到基態(tài)。建立在發(fā)生熒光現(xiàn)象基礎(chǔ)上的分析方法，稱為分子熒光分析法，而常把被測(cè)物稱為熒光物質(zhì)。在稀溶液中，熒光強(qiáng)度IF與入射光的強(qiáng)度10、熒光量子效率叫以及熒光物質(zhì)的濃度c等有關(guān)，可表示為If=KfI0bc。式中為比例常數(shù)，與儀器的參數(shù)固定后，以最大激發(fā)波長的光為入射光，測(cè)定最大發(fā)射波長光的強(qiáng)度時(shí)，熒光強(qiáng)度

2、If與熒光物質(zhì)的濃度c成正比。核黃素（維生素B2）是一種異咯嗪衍生物，它在中性或弱酸性的水溶液中為黃色并且有很強(qiáng)的熒光。這種熒光在強(qiáng)酸和強(qiáng)堿中易被破壞。核黃素可被亞硫酸鹽還原成無色的二氫化物，同時(shí)失去熒光，因而樣品的熒光背景可以被測(cè)定。OH2H2HOONHH3CH3CH3C二氫化物在空氣中易重新氧化，恢復(fù)其熒光，其反應(yīng)如下：核黃素的激發(fā)光波長范圍約為44500nm（一般為440nm），發(fā)射光波長范圍約為510550nm（般為520nm）。利用核黃素在稀溶液中熒光的強(qiáng)度與核黃素的濃度成正比，由還原前后的熒光差數(shù)可進(jìn)行定量測(cè)定。根據(jù)核黃素的熒光特性亦可進(jìn)行定性鑒別。注意：在所有的操作過程中，要避免

3、核黃素受陽光直接照射。儀器與試劑實(shí)驗(yàn)試劑：核黃素標(biāo)準(zhǔn)品；冰醋酸；核黃素藥片；連二亞硫酸鈉(保險(xiǎn)粉)或亞硫酸鈉實(shí)驗(yàn)儀器：熒光光度計(jì)(F-2500型)天平(感量O.OOOlg)實(shí)驗(yàn)器材普通試管：25mLx9容量瓶：lOOmLxl移液管：lOmLxl5mLx1lmLxl燒杯：50mLxl濾紙：9cm研缽、漏斗、洗瓶、洗耳球、試管架、移液管架、玻棒：各l實(shí)驗(yàn)內(nèi)容核黃素標(biāo)準(zhǔn)液(4xlO-6gmL-l)準(zhǔn)確稱取核黃素4mg,加5mL冰醋酸和適量蒸餾水，置水浴中避光加熱直至溶解。冷卻至室溫，用蒸餾水定容至lOOOmL。轉(zhuǎn)入棕色瓶中。樣品液的制備為了消除藥片之間的差異，可取幾片藥片一起研磨，然后取部分有代表性

4、的樣品進(jìn)行分析。將5片核黃素藥片稱量后磨成粉末，然后從中準(zhǔn)確稱取l-2mg有代表性的樣品，加0.5mL冰醋酸和適量蒸餾水，置水浴中避光加熱直至溶解。冷卻至室溫，用蒸餾水定容至lOOmL(如果有沉淀，迅速通過定量濾紙干過濾，用該濾液在與標(biāo)準(zhǔn)溶液同樣條件下測(cè)量核黃素的熒光強(qiáng)度)。轉(zhuǎn)入棕色瓶中。作樣品待測(cè)液備用。繪制核黃素的激發(fā)光譜和熒光光譜.固定激發(fā)波長九ex(Excitationspectra)為440nm,在460-660nm處測(cè)定熒光強(qiáng)度，得溶液的發(fā)射光譜，在520nm處得最大發(fā)射波長九em。.再固定發(fā)射波長九em(emissionspectra)為520nm，測(cè)定激發(fā)波長九ex為400-5

5、00nm處熒光強(qiáng)度，得溶液的激發(fā)光譜，在440nm處得最大激發(fā)波長九ex標(biāo)準(zhǔn)曲線制作及樣品測(cè)定取8支試管，按下表所示順序操作。管號(hào)操作標(biāo)準(zhǔn)核黃素濃度梯度樣品123456III核黃素標(biāo)準(zhǔn)液(mL)0.250.501.001.502.002.50樣品待測(cè)液(mL)10.0010.00蒸餾水(mL)9.759.509.008.508.007.50熒光測(cè)定激發(fā)波長-440nm，發(fā)射波分別測(cè)定各管的熒光弓長一520nm，雖度。F1還原反應(yīng)在各管中分別加入約10mg的連一硫酸鈉或亞硫酸鈉，混合溶解后，立即重新測(cè)定熒光強(qiáng)度f2F2注意：在測(cè)定中如果待測(cè)樣品溶液的熒光強(qiáng)度超出100%，則需要再行稀釋，并記錄稀

6、釋倍數(shù)。結(jié)果處理從繪制的激發(fā)光譜和熒光光譜曲線上，確定它們的最大激發(fā)波長和最大發(fā)射波長。由16號(hào)管的數(shù)據(jù)，以核黃素含量(10-6gmL-1)為橫坐標(biāo)，F(xiàn)值(F1-F2)為縱坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；求兩個(gè)樣品管F的平均值；由F從標(biāo)準(zhǔn)曲線中求樣品管中核黃素的含量(10ygmL-1)；計(jì)算藥片中核黃素的含量(單位用g/g鮮重)，并將測(cè)定值與說明書上的值比較。注意事項(xiàng)在所有的操作過程中，避免核黃素受陽光直接照射。使用石英樣品池時(shí)，應(yīng)手持其棱角處，不能接觸光面，用畢后，將其清洗干凈。影響熒光強(qiáng)度的因素很多，每次測(cè)定的條件很難完全控制一致，因此每次必須做工作曲線，且標(biāo)準(zhǔn)曲線最好與樣品同時(shí)做。F-25

7、00分子熒光光度計(jì)操作規(guī)程1.先打開儀器主機(jī)，打開電腦2.點(diǎn)擊桌面FLSolutions3.尋找激發(fā)波長：放入樣品，尋找激發(fā)波長，點(diǎn)擊Method，出現(xiàn)對(duì)話框，點(diǎn)擊General，在Measurement中選擇wavelengthscan，點(diǎn)擊Instrument，在scanmode中選擇Excitation，在datamode中只選Fluorescence,在EMWL中輸入發(fā)射波長數(shù)值(520nm)。在EXstart中輸入激發(fā)起始波長(400nm),在EXendWL中輸入激發(fā)終止波長(500nm)。點(diǎn)擊確定即可得到熒光物質(zhì)的激發(fā)光譜曲線。尋找發(fā)射波長：同上法。在scanmode中選Emiss

8、iono在datamode中只選Fluorescence，在EXWL中輸入激發(fā)波長數(shù)值(440nm)。在EMstart中輸入發(fā)射起始波長(460nm)，在EMendWL中輸入發(fā)射終止波長(600nm)。點(diǎn)擊確定即可得到熒光物質(zhì)的發(fā)射光譜曲線。將樣品放入，在scanmode中選Emission。在datamode中只選Fluorescence，在EXWL中輸入激發(fā)波長數(shù)值(440nm)。在EMstart中輸入發(fā)射起始波長(460nm)，在EMendWL中輸入發(fā)射終止波長(600nm)。點(diǎn)擊確定即可得到熒光物質(zhì)的發(fā)射光譜曲線。記錄在520nm處的熒光值Fl。加入10mg的連二硫酸鈉或亞硫酸鈉，混合溶解后，立即重新測(cè)定相對(duì)熒光強(qiáng)度F2在完成測(cè)量之后，關(guān)閉儀器按下列步驟執(zhí)行。從文件菜單(F)中，選擇退出(X)指令。Oclosethemonitorwindow,butkeeplampoperating?Oclosethelamp，thenclosethemonitorwindow.選擇yes，F(xiàn)LSolutions程序?qū)⒔K止。關(guān)閉光度計(jì)的電源開關(guān)。點(diǎn)擊Windows98的開始按鈕，選擇關(guān)機(jī)(U),在關(guān)機(jī)窗口對(duì)