抗體制藥主題醫(yī)學(xué)知識培訓(xùn)課件

1、抗體制藥主題醫(yī)學(xué)知識抗體制藥主題醫(yī)學(xué)知識抗體？ 抗體是指能與相應(yīng)特異性結(jié)合的具有免疫功能的球蛋白（Ig）。它是機(jī)體免疫系統(tǒng)受抗原物質(zhì)刺激后，B淋巴細(xì)胞被活化、增值和分化為漿細(xì)胞合成和分泌的球蛋白。第一節(jié) 概 述抗體制藥主題醫(yī)學(xué)知識2抗體？第一節(jié) 概 述抗體制藥主題醫(yī)學(xué)知識2抗原決定簇？ 是指抗原分子中決定抗原特異性的特殊化學(xué)基團(tuán)，又稱表團(tuán)，通常由5-7個氨基酸殘基或5-7個多糖殘基/核苷酸組成。抗原決定蔟是T細(xì)胞受體、B細(xì)胞受體和抗體識別結(jié)合的基本單位，他們之間的相互作用具有高度特異性。如：菌體抗原（O抗原）、鞭毛抗原（H抗原）等。第一節(jié) 概 述抗體制藥主題醫(yī)學(xué)知識3抗原決定簇？第一節(jié) 概 述

2、抗體制藥主題醫(yī)學(xué)知識3多克隆抗體？ 病原微生物含有多種抗原決定簇的抗原物質(zhì)，因此這些抗體制劑也是多種抗體的混合物，故稱多克隆抗體，會給治療和診斷帶來誤差。第一節(jié) 概 述抗體制藥主題醫(yī)學(xué)知識4多克隆抗體？第一節(jié) 概 述抗體制藥主題醫(yī)學(xué)知識4單克隆抗體？1975年Kohler和Milstein首先利用B淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)制備出單克隆抗體。他們將抗體產(chǎn)生細(xì)胞于具有無限增殖能力的骨髓瘤細(xì)胞相融合，通過有限稀釋法及克隆化使雜交瘤細(xì)胞成為純一的單克隆細(xì)胞系，此細(xì)胞系能產(chǎn)生結(jié)構(gòu)和特異性完全相同的高純度抗體。第一節(jié) 概 述抗體制藥主題醫(yī)學(xué)知識5單克隆抗體？第一節(jié) 概 述抗體制藥主題醫(yī)學(xué)知識5單克隆抗體？由一種

3、抗原決定簇刺激機(jī)體，由一個B淋巴細(xì)胞接受該抗原所產(chǎn)生的抗體。單克隆抗體具有高度特異性、均一性、來源穩(wěn)定、可大量生產(chǎn)等特點(diǎn)。第一節(jié) 概 述抗體制藥主題醫(yī)學(xué)知識6單克隆抗體？第一節(jié) 概 述抗體制藥主題醫(yī)學(xué)知識6以單克隆抗體作為載體的藥物可對腫瘤進(jìn)行定向治療。但是，臨床應(yīng)用的實踐證明，免疫導(dǎo)向法并沒有成功，其障礙有：單克隆抗體均是鼠源性抗體，應(yīng)用于人體內(nèi)可產(chǎn) 生人鼠抗體，加速了排斥反應(yīng)，在人體內(nèi)半衰期 只有56h，難以維持有效藥物作用靶組織時間。完整的抗體分子，即Ig的相對分子質(zhì)量過大，難 以穿透實體腫瘤組織，達(dá)不到有效的治療濃度。第一節(jié) 概 述抗體制藥主題醫(yī)學(xué)知識7以單克隆抗體作為載體的藥物可對腫

4、瘤進(jìn)行定向治第一節(jié) 概 述抗基于上述原因，需從兩個方面對單克隆抗體加以改造：降低單克隆抗體的免疫原性。降低單克隆抗體的相對分子質(zhì)量。利用基因工程技術(shù)制備出基因工程抗體，即可達(dá)到上述目的。第一節(jié) 概 述抗體制藥主題醫(yī)學(xué)知識8基于上述原因，需從兩個方面對單克隆抗體第一節(jié) 概 述抗體制藥單克隆抗體藥的現(xiàn)狀抗體藥的銷售額 97年99年由4.68億美元增長到13億美元 03年抗體類藥物總銷售額將會達(dá)到50億美元250多種抗體類藥物在臨床試驗中 1/3 已進(jìn)入三期臨床 1/4 已通過臨床三期試驗美國市場上有種治療用的抗體藥物第一節(jié) 概 述抗體制藥主題醫(yī)學(xué)知識9單克隆抗體藥的現(xiàn)狀第一節(jié) 概 述抗體制藥主題醫(yī)

5、學(xué)知識9單克隆抗體藥的現(xiàn)狀1994年，Centocor 的Reopro一種血小板表面受體的單克隆抗體片段被批準(zhǔn)用于臨床來預(yù)防治療血栓形成1997年批準(zhǔn)上市的12種生物新藥中有2種是抗體藥1998年上市的12種新藥中有6種是抗體藥2000年又批準(zhǔn)了Mylotarg用于治療急性髓細(xì)胞白血病的抗CD33單克隆抗體2001年已批準(zhǔn)及預(yù)期會被批準(zhǔn)的10多種生物新藥中，也有5種是屬于抗體類藥第一節(jié) 概 述抗體制藥主題醫(yī)學(xué)知識10單克隆抗體藥的現(xiàn)狀第一節(jié) 概 述抗體制藥主題醫(yī)學(xué)知識10抗體藥物市場穩(wěn)步增長第一節(jié) 概 述抗體制藥主題醫(yī)學(xué)知識11抗體藥物市場穩(wěn)步增長第一節(jié) 概 述抗體制藥主題醫(yī)學(xué)知識11第一節(jié)

6、概 述抗體制藥主題醫(yī)學(xué)知識12第一節(jié) 概 述抗體制藥主題醫(yī)學(xué)知識12全球有超過200家上市或未上市公司正在研發(fā)用于臨床診斷和治療的單克隆抗體正在進(jìn)行臨床試驗的抗體公司（38家）第一節(jié) 概 述抗體制藥主題醫(yī)學(xué)知識13全球有超過200家上市或未上市公司正在研發(fā)用第一節(jié) 概 述抗當(dāng)前美國治療性抗體市場第一節(jié) 概 述抗體制藥主題醫(yī)學(xué)知識14當(dāng)前美國治療性抗體市場第一節(jié) 概 述抗體制藥主題醫(yī)學(xué)知識14當(dāng)前美國治療性抗體市場第一節(jié) 概 述抗體制藥主題醫(yī)學(xué)知識15當(dāng)前美國治療性抗體市場第一節(jié) 概 述抗體制藥主題醫(yī)學(xué)知識15中國抗體研究現(xiàn)狀第一節(jié) 概 述抗體制藥主題醫(yī)學(xué)知識16中國抗體研究現(xiàn)狀第一節(jié) 概 述抗

7、體制藥主題醫(yī)學(xué)知識16第二節(jié) 單克隆抗體及其制備一、抗原與動物免疫二、細(xì)胞融合與雜交瘤細(xì)胞的選擇三、篩選陽性克隆與克隆化四、雜交瘤細(xì)胞抗體形狀的鑒定五、單克隆抗體的大量制備六、單克隆抗體的純化抗體制藥主題醫(yī)學(xué)知識17第二節(jié) 單克隆抗體及其制備一、抗原與動物免疫抗體制藥主題醫(yī)學(xué)第二節(jié) 單克隆抗體及其制備設(shè)計方案：一個B淋巴細(xì)胞-只分泌一種特異性抗體小鼠骨髓瘤細(xì)胞-能無限增殖雜種細(xì)胞抗體制藥主題醫(yī)學(xué)知識18第二節(jié) 單克隆抗體及其制備設(shè)計方案：雜種細(xì)胞抗體制藥主題醫(yī)學(xué)第二節(jié) 單克隆抗體及其制備抗體制藥主題醫(yī)學(xué)知識19第二節(jié) 單克隆抗體及其制備抗體制藥主題醫(yī)學(xué)知識19第二節(jié) 單克隆抗體及其制備 雜交瘤

8、技術(shù)產(chǎn)生的3個技術(shù)關(guān)鍵1.B淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞的特性： B淋巴細(xì)胞（B lymphocytes）： 接受抗原刺激后，能分泌針對該抗原的特異性抗體，在體液免疫中具有重要功能。 B淋巴細(xì)胞本身是一種終末分化細(xì)胞，通常不再進(jìn)行細(xì)胞分裂，存活一點(diǎn)時間后便會死亡-短命細(xì)胞抗體制藥主題醫(yī)學(xué)知識20第二節(jié) 單克隆抗體及其制備 雜交瘤技術(shù)產(chǎn)生的3個技術(shù)關(guān)鍵抗第二節(jié) 單克隆抗體及其制備骨髓瘤細(xì)胞（myeloma cells）： 惡性增殖的轉(zhuǎn)化細(xì)胞，只要營養(yǎng)條件適合可永遠(yuǎn)分裂和存活-長命細(xì)胞。 經(jīng)篩選與馴化，現(xiàn)已建立多種骨髓瘤細(xì)胞-沒有抗體分泌物。抗體制藥主題醫(yī)學(xué)知識21第二節(jié) 單克隆抗體及其制備骨髓瘤細(xì)胞（m

9、yeloma cel第二節(jié) 單克隆抗體及其制備2. 細(xì)胞融合技術(shù)： 抗體制藥主題醫(yī)學(xué)知識22第二節(jié) 單克隆抗體及其制備2. 細(xì)胞融合技術(shù)：抗體制藥主題醫(yī)第二節(jié) 單克隆抗體及其制備3. 雜交瘤細(xì)胞的篩選： 抗體制藥主題醫(yī)學(xué)知識23第二節(jié) 單克隆抗體及其制備3. 雜交瘤細(xì)胞的篩選：抗體制藥主第二節(jié) 單克隆抗體及其制備抗體制藥主題醫(yī)學(xué)知識24第二節(jié) 單克隆抗體及其制備抗體制藥主題醫(yī)學(xué)知識24第二節(jié) 單克隆抗體及其制備抗體制藥主題醫(yī)學(xué)知識25第二節(jié) 單克隆抗體及其制備抗體制藥主題醫(yī)學(xué)知識25第二節(jié) 單克隆抗體及其制備抗體制藥主題醫(yī)學(xué)知識26第二節(jié) 單克隆抗體及其制備抗體制藥主題醫(yī)學(xué)知識26第二節(jié) 單克

10、隆抗體及其制備抗體制藥主題醫(yī)學(xué)知識27第二節(jié) 單克隆抗體及其制備抗體制藥主題醫(yī)學(xué)知識27第二節(jié) 單克隆抗體及其制備一、抗原與動物免疫抗體制藥主題醫(yī)學(xué)知識28第二節(jié) 單克隆抗體及其制備一、抗原與動物免疫抗體制藥主題醫(yī)學(xué)第二節(jié) 單克隆抗體及其制備抗體制藥主題醫(yī)學(xué)知識29第二節(jié) 單克隆抗體及其制備抗體制藥主題醫(yī)學(xué)知識29第二節(jié) 單克隆抗體及其制備1.抗原 動物體內(nèi) 抗體 特異性差、純度低產(chǎn)量低，反應(yīng)不夠靈敏 2. 抗原 動物體內(nèi) 抗體 抗原不純 抗體不純 篩選單一效應(yīng)B細(xì)胞 不能增殖，產(chǎn)生大量抗體 刺激效應(yīng)B刺激效應(yīng)B抗體制藥主題醫(yī)學(xué)知識30第二節(jié) 單克隆抗體及其制備1.抗原 動物體內(nèi) 第二節(jié) 單克

11、隆抗體及其制備動物免疫:特定目標(biāo)抗原動物脾臟中B淋巴細(xì)胞B淋巴細(xì)胞大量繁殖免疫刺激能分泌針對于該抗原的特異性抗體目的：在細(xì)胞融合后獲得盡可能多的分泌針對于該目標(biāo)抗原的特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞抗體制藥主題醫(yī)學(xué)知識31第二節(jié) 單克隆抗體及其制備動物免疫:特定目標(biāo)抗原動物脾臟中B第二節(jié) 單克隆抗體及其制備常用免疫方法： 常規(guī)免疫法 “穩(wěn)妥；優(yōu)勢克隆” 脾內(nèi)一次性免疫法 “省時；省抗原” 短程免疫法 “省時” 體外免疫法 “操作繁瑣”免疫途徑：皮下注射腹腔注射靜脈注射抗體制藥主題醫(yī)學(xué)知識32第二節(jié) 單克隆抗體及其制備常用免疫方法： 常規(guī)免疫法 第二節(jié) 單克隆抗體及其制備常規(guī)免疫法：抗體制藥主題醫(yī)學(xué)知識3

12、3第二節(jié) 單克隆抗體及其制備常規(guī)免疫法：抗體制藥主題醫(yī)學(xué)知識3第二節(jié) 單克隆抗體及其制備脾內(nèi)免疫法： 脾內(nèi)免疫法即在麻醉條件下直接把0.10.2ml的抗原注入脾臟進(jìn)行免疫。脾內(nèi)免疫法可提高小鼠對抗原的免疫反應(yīng)，節(jié)省抗原用量，細(xì)胞抗原只需105個左右，可溶性抗原只需10g左右。抗體制藥主題醫(yī)學(xué)知識34第二節(jié) 單克隆抗體及其制備脾內(nèi)免疫法： 脾內(nèi)免抗體制藥主題醫(yī)學(xué)知識培訓(xùn)課件第二節(jié) 單克隆抗體及其制備二、細(xì)胞融合與雜交瘤細(xì)胞的選擇細(xì)胞融合方法： 病毒介導(dǎo)的細(xì)胞融合 PEG 介導(dǎo)細(xì)胞融合 電極融合抗體制藥主題醫(yī)學(xué)知識36第二節(jié) 單克隆抗體及其制備二、細(xì)胞融合與雜交瘤細(xì)胞的選擇細(xì)胞第二節(jié) 單克隆抗體及

13、其制備細(xì)胞懸液的制備與融合 脾細(xì)胞懸液的制備：最后一次免疫后第3天制備 骨髓瘤細(xì)胞懸液的制備： 于對數(shù)生長期制備 細(xì)胞融合：5% PEG （10004000），pH8.0， 38， 1min 抗體制藥主題醫(yī)學(xué)知識37第二節(jié) 單克隆抗體及其制備細(xì)胞懸液的制備與融合 脾細(xì)胞懸液第二節(jié) 單克隆抗體及其制備2. HAT培養(yǎng)基的篩選融合后細(xì)胞混合液HAT培養(yǎng)基HT培養(yǎng)基正常培養(yǎng)基2 weeks later1 week later抗體制藥主題醫(yī)學(xué)知識38第二節(jié) 單克隆抗體及其制備2. HAT培養(yǎng)基的篩選融合后細(xì)胞第二節(jié) 單克隆抗體及其制備三、篩選陽性克隆與克隆化常用方法：要求： 簡便、快速、敏感； 在短時

14、間能檢測大量樣品 酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay， ELISA）間接免疫熒光法（Indirect immunofluorescence， IFA） 放射免疫法（radioimmunoassay， RIA）雙向擴(kuò)散法抗體制藥主題醫(yī)學(xué)知識39第二節(jié) 單克隆抗體及其制備三、篩選陽性克隆與克隆化常用方法：第二節(jié) 單克隆抗體及其制備酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）技術(shù)原理：抗體制藥主題醫(yī)學(xué)知識40第二節(jié) 單克隆抗體及其制備酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）技術(shù)原第二節(jié) 單克隆抗體及其制備四、克隆化常用克隆化方法：有限稀釋法軟瓊脂平板法顯微操作法 80 個細(xì)/96

15、孔飼養(yǎng)細(xì)胞（feeder cells） ELISA 法檢測單克隆雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)上清，選出分泌特異性抗體的陽性孔，所分泌抗體即為單克隆抗體?？贵w制藥主題醫(yī)學(xué)知識41第二節(jié) 單克隆抗體及其制備四、克隆化常用克隆化方法：有限稀釋第二節(jié) 單克隆抗體及其制備單克隆抗體（monoclonal antibody，MAb）由單一克隆的雜交瘤細(xì)胞分泌的抗體，只針對于一個抗原決定簇-單克隆抗體（monoclonal antibody， MAb）單克隆抗體優(yōu)點(diǎn)：高度純一高度專一應(yīng)用： 疾病的論斷和治療（生物導(dǎo)彈） 生物大分子的鑒定、定位和分離純化 細(xì)胞器的鑒定、定位和分離 特定細(xì)胞或病毒的鑒定、定位很分離抗體制藥

16、主題醫(yī)學(xué)知識42第二節(jié) 單克隆抗體及其制備單克隆抗體（monoclonal 第二節(jié) 單克隆抗體及其制備五、單克隆抗體的大量制備常用的大規(guī)模培養(yǎng)方法：動物接種法轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)法細(xì)胞培養(yǎng)罐法抗體制藥主題醫(yī)學(xué)知識43第二節(jié) 單克隆抗體及其制備五、單克隆抗體的大量制備常用的大規(guī)第二節(jié) 單克隆抗體及其制備五、單克隆抗體的大量制備大量制備單克隆抗體的方法主要有兩種： 體外培養(yǎng)法：10g/ml 動物體內(nèi)誘生法：520mg/mlBALB/c小鼠優(yōu)點(diǎn)：操作簡便，比較經(jīng)濟(jì)，所得單克隆抗體較多且效價較高。缺點(diǎn)：混有雜蛋白有血清培養(yǎng)法；無血清培養(yǎng)法抗體制藥主題醫(yī)學(xué)知識44第二節(jié) 單克隆抗體及其制備五、單克隆抗體的大量制備大量制備單第二節(jié) 單克隆抗體及其制備抗體制藥主題醫(yī)學(xué)知識45第二節(jié) 單克隆抗體及其制備抗體制藥主題醫(yī)學(xué)知識45第二節(jié) 單克隆抗體及其制備動物接種法轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)法細(xì)胞培養(yǎng)罐法抗體制藥主題醫(yī)學(xué)知識46第二節(jié) 單克隆抗體及其制備動物接種法抗體制藥主題醫(yī)學(xué)知