抗體制藥主題醫(yī)學(xué)知識(shí)培訓(xùn)課件

1、抗體制藥主題醫(yī)學(xué)知識(shí)抗體制藥主題醫(yī)學(xué)知識(shí)抗體？ 抗體是指能與相應(yīng)特異性結(jié)合的具有免疫功能的球蛋白（Ig）。它是機(jī)體免疫系統(tǒng)受抗原物質(zhì)刺激后，B淋巴細(xì)胞被活化、增值和分化為漿細(xì)胞合成和分泌的球蛋白。第一節(jié) 概 述抗體制藥主題醫(yī)學(xué)知識(shí)2抗體？第一節(jié) 概 述抗體制藥主題醫(yī)學(xué)知識(shí)2抗原決定簇？ 是指抗原分子中決定抗原特異性的特殊化學(xué)基團(tuán)，又稱(chēng)表團(tuán)，通常由5-7個(gè)氨基酸殘基或5-7個(gè)多糖殘基/核苷酸組成?？乖瓫Q定蔟是T細(xì)胞受體、B細(xì)胞受體和抗體識(shí)別結(jié)合的基本單位，他們之間的相互作用具有高度特異性。如：菌體抗原（O抗原）、鞭毛抗原（H抗原）等。第一節(jié) 概 述抗體制藥主題醫(yī)學(xué)知識(shí)3抗原決定簇？第一節(jié) 概 述

2、抗體制藥主題醫(yī)學(xué)知識(shí)3多克隆抗體？ 病原微生物含有多種抗原決定簇的抗原物質(zhì)，因此這些抗體制劑也是多種抗體的混合物，故稱(chēng)多克隆抗體，會(huì)給治療和診斷帶來(lái)誤差。第一節(jié) 概 述抗體制藥主題醫(yī)學(xué)知識(shí)4多克隆抗體？第一節(jié) 概 述抗體制藥主題醫(yī)學(xué)知識(shí)4單克隆抗體？1975年Kohler和Milstein首先利用B淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)制備出單克隆抗體。他們將抗體產(chǎn)生細(xì)胞于具有無(wú)限增殖能力的骨髓瘤細(xì)胞相融合，通過(guò)有限稀釋法及克隆化使雜交瘤細(xì)胞成為純一的單克隆細(xì)胞系，此細(xì)胞系能產(chǎn)生結(jié)構(gòu)和特異性完全相同的高純度抗體。第一節(jié) 概 述抗體制藥主題醫(yī)學(xué)知識(shí)5單克隆抗體？第一節(jié) 概 述抗體制藥主題醫(yī)學(xué)知識(shí)5單克隆抗體？由一種

3、抗原決定簇刺激機(jī)體，由一個(gè)B淋巴細(xì)胞接受該抗原所產(chǎn)生的抗體。單克隆抗體具有高度特異性、均一性、來(lái)源穩(wěn)定、可大量生產(chǎn)等特點(diǎn)。第一節(jié) 概 述抗體制藥主題醫(yī)學(xué)知識(shí)6單克隆抗體？第一節(jié) 概 述抗體制藥主題醫(yī)學(xué)知識(shí)6以單克隆抗體作為載體的藥物可對(duì)腫瘤進(jìn)行定向治療。但是，臨床應(yīng)用的實(shí)踐證明，免疫導(dǎo)向法并沒(méi)有成功，其障礙有：?jiǎn)慰寺】贵w均是鼠源性抗體，應(yīng)用于人體內(nèi)可產(chǎn) 生人鼠抗體，加速了排斥反應(yīng)，在人體內(nèi)半衰期 只有56h，難以維持有效藥物作用靶組織時(shí)間。完整的抗體分子，即Ig的相對(duì)分子質(zhì)量過(guò)大，難 以穿透實(shí)體腫瘤組織，達(dá)不到有效的治療濃度。第一節(jié) 概 述抗體制藥主題醫(yī)學(xué)知識(shí)7以單克隆抗體作為載體的藥物可對(duì)腫

4、瘤進(jìn)行定向治第一節(jié) 概 述抗基于上述原因，需從兩個(gè)方面對(duì)單克隆抗體加以改造：降低單克隆抗體的免疫原性。降低單克隆抗體的相對(duì)分子質(zhì)量。利用基因工程技術(shù)制備出基因工程抗體，即可達(dá)到上述目的。第一節(jié) 概 述抗體制藥主題醫(yī)學(xué)知識(shí)8基于上述原因，需從兩個(gè)方面對(duì)單克隆抗體第一節(jié) 概 述抗體制藥單克隆抗體藥的現(xiàn)狀抗體藥的銷(xiāo)售額 97年99年由4.68億美元增長(zhǎng)到13億美元 03年抗體類(lèi)藥物總銷(xiāo)售額將會(huì)達(dá)到50億美元250多種抗體類(lèi)藥物在臨床試驗(yàn)中 1/3 已進(jìn)入三期臨床 1/4 已通過(guò)臨床三期試驗(yàn)美國(guó)市場(chǎng)上有種治療用的抗體藥物第一節(jié) 概 述抗體制藥主題醫(yī)學(xué)知識(shí)9單克隆抗體藥的現(xiàn)狀第一節(jié) 概 述抗體制藥主題醫(yī)

5、學(xué)知識(shí)9單克隆抗體藥的現(xiàn)狀1994年，Centocor 的Reopro一種血小板表面受體的單克隆抗體片段被批準(zhǔn)用于臨床來(lái)預(yù)防治療血栓形成1997年批準(zhǔn)上市的12種生物新藥中有2種是抗體藥1998年上市的12種新藥中有6種是抗體藥2000年又批準(zhǔn)了Mylotarg用于治療急性髓細(xì)胞白血病的抗CD33單克隆抗體2001年已批準(zhǔn)及預(yù)期會(huì)被批準(zhǔn)的10多種生物新藥中，也有5種是屬于抗體類(lèi)藥第一節(jié) 概 述抗體制藥主題醫(yī)學(xué)知識(shí)10單克隆抗體藥的現(xiàn)狀第一節(jié) 概 述抗體制藥主題醫(yī)學(xué)知識(shí)10抗體藥物市場(chǎng)穩(wěn)步增長(zhǎng)第一節(jié) 概 述抗體制藥主題醫(yī)學(xué)知識(shí)11抗體藥物市場(chǎng)穩(wěn)步增長(zhǎng)第一節(jié) 概 述抗體制藥主題醫(yī)學(xué)知識(shí)11第一節(jié)

6、概 述抗體制藥主題醫(yī)學(xué)知識(shí)12第一節(jié) 概 述抗體制藥主題醫(yī)學(xué)知識(shí)12全球有超過(guò)200家上市或未上市公司正在研發(fā)用于臨床診斷和治療的單克隆抗體正在進(jìn)行臨床試驗(yàn)的抗體公司（38家）第一節(jié) 概 述抗體制藥主題醫(yī)學(xué)知識(shí)13全球有超過(guò)200家上市或未上市公司正在研發(fā)用第一節(jié) 概 述抗當(dāng)前美國(guó)治療性抗體市場(chǎng)第一節(jié) 概 述抗體制藥主題醫(yī)學(xué)知識(shí)14當(dāng)前美國(guó)治療性抗體市場(chǎng)第一節(jié) 概 述抗體制藥主題醫(yī)學(xué)知識(shí)14當(dāng)前美國(guó)治療性抗體市場(chǎng)第一節(jié) 概 述抗體制藥主題醫(yī)學(xué)知識(shí)15當(dāng)前美國(guó)治療性抗體市場(chǎng)第一節(jié) 概 述抗體制藥主題醫(yī)學(xué)知識(shí)15中國(guó)抗體研究現(xiàn)狀第一節(jié) 概 述抗體制藥主題醫(yī)學(xué)知識(shí)16中國(guó)抗體研究現(xiàn)狀第一節(jié) 概 述抗

7、體制藥主題醫(yī)學(xué)知識(shí)16第二節(jié) 單克隆抗體及其制備一、抗原與動(dòng)物免疫二、細(xì)胞融合與雜交瘤細(xì)胞的選擇三、篩選陽(yáng)性克隆與克隆化四、雜交瘤細(xì)胞抗體形狀的鑒定五、單克隆抗體的大量制備六、單克隆抗體的純化抗體制藥主題醫(yī)學(xué)知識(shí)17第二節(jié) 單克隆抗體及其制備一、抗原與動(dòng)物免疫抗體制藥主題醫(yī)學(xué)第二節(jié) 單克隆抗體及其制備設(shè)計(jì)方案：一個(gè)B淋巴細(xì)胞-只分泌一種特異性抗體小鼠骨髓瘤細(xì)胞-能無(wú)限增殖雜種細(xì)胞抗體制藥主題醫(yī)學(xué)知識(shí)18第二節(jié) 單克隆抗體及其制備設(shè)計(jì)方案：雜種細(xì)胞抗體制藥主題醫(yī)學(xué)第二節(jié) 單克隆抗體及其制備抗體制藥主題醫(yī)學(xué)知識(shí)19第二節(jié) 單克隆抗體及其制備抗體制藥主題醫(yī)學(xué)知識(shí)19第二節(jié) 單克隆抗體及其制備 雜交瘤

8、技術(shù)產(chǎn)生的3個(gè)技術(shù)關(guān)鍵1.B淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞的特性： B淋巴細(xì)胞（B lymphocytes）： 接受抗原刺激后，能分泌針對(duì)該抗原的特異性抗體，在體液免疫中具有重要功能。 B淋巴細(xì)胞本身是一種終末分化細(xì)胞，通常不再進(jìn)行細(xì)胞分裂，存活一點(diǎn)時(shí)間后便會(huì)死亡-短命細(xì)胞抗體制藥主題醫(yī)學(xué)知識(shí)20第二節(jié) 單克隆抗體及其制備 雜交瘤技術(shù)產(chǎn)生的3個(gè)技術(shù)關(guān)鍵抗第二節(jié) 單克隆抗體及其制備骨髓瘤細(xì)胞（myeloma cells）： 惡性增殖的轉(zhuǎn)化細(xì)胞，只要營(yíng)養(yǎng)條件適合可永遠(yuǎn)分裂和存活-長(zhǎng)命細(xì)胞。 經(jīng)篩選與馴化，現(xiàn)已建立多種骨髓瘤細(xì)胞-沒(méi)有抗體分泌物?？贵w制藥主題醫(yī)學(xué)知識(shí)21第二節(jié) 單克隆抗體及其制備骨髓瘤細(xì)胞（m

9、yeloma cel第二節(jié) 單克隆抗體及其制備2. 細(xì)胞融合技術(shù)： 抗體制藥主題醫(yī)學(xué)知識(shí)22第二節(jié) 單克隆抗體及其制備2. 細(xì)胞融合技術(shù)：抗體制藥主題醫(yī)第二節(jié) 單克隆抗體及其制備3. 雜交瘤細(xì)胞的篩選： 抗體制藥主題醫(yī)學(xué)知識(shí)23第二節(jié) 單克隆抗體及其制備3. 雜交瘤細(xì)胞的篩選：抗體制藥主第二節(jié) 單克隆抗體及其制備抗體制藥主題醫(yī)學(xué)知識(shí)24第二節(jié) 單克隆抗體及其制備抗體制藥主題醫(yī)學(xué)知識(shí)24第二節(jié) 單克隆抗體及其制備抗體制藥主題醫(yī)學(xué)知識(shí)25第二節(jié) 單克隆抗體及其制備抗體制藥主題醫(yī)學(xué)知識(shí)25第二節(jié) 單克隆抗體及其制備抗體制藥主題醫(yī)學(xué)知識(shí)26第二節(jié) 單克隆抗體及其制備抗體制藥主題醫(yī)學(xué)知識(shí)26第二節(jié) 單克

10、隆抗體及其制備抗體制藥主題醫(yī)學(xué)知識(shí)27第二節(jié) 單克隆抗體及其制備抗體制藥主題醫(yī)學(xué)知識(shí)27第二節(jié) 單克隆抗體及其制備一、抗原與動(dòng)物免疫抗體制藥主題醫(yī)學(xué)知識(shí)28第二節(jié) 單克隆抗體及其制備一、抗原與動(dòng)物免疫抗體制藥主題醫(yī)學(xué)第二節(jié) 單克隆抗體及其制備抗體制藥主題醫(yī)學(xué)知識(shí)29第二節(jié) 單克隆抗體及其制備抗體制藥主題醫(yī)學(xué)知識(shí)29第二節(jié) 單克隆抗體及其制備1.抗原 動(dòng)物體內(nèi) 抗體 特異性差、純度低產(chǎn)量低，反應(yīng)不夠靈敏 2. 抗原 動(dòng)物體內(nèi) 抗體 抗原不純 抗體不純 篩選單一效應(yīng)B細(xì)胞 不能增殖，產(chǎn)生大量抗體 刺激效應(yīng)B刺激效應(yīng)B抗體制藥主題醫(yī)學(xué)知識(shí)30第二節(jié) 單克隆抗體及其制備1.抗原 動(dòng)物體內(nèi) 第二節(jié) 單克

11、隆抗體及其制備動(dòng)物免疫:特定目標(biāo)抗原動(dòng)物脾臟中B淋巴細(xì)胞B淋巴細(xì)胞大量繁殖免疫刺激能分泌針對(duì)于該抗原的特異性抗體目的：在細(xì)胞融合后獲得盡可能多的分泌針對(duì)于該目標(biāo)抗原的特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞抗體制藥主題醫(yī)學(xué)知識(shí)31第二節(jié) 單克隆抗體及其制備動(dòng)物免疫:特定目標(biāo)抗原動(dòng)物脾臟中B第二節(jié) 單克隆抗體及其制備常用免疫方法： 常規(guī)免疫法 “穩(wěn)妥；優(yōu)勢(shì)克隆” 脾內(nèi)一次性免疫法 “省時(shí)；省抗原” 短程免疫法 “省時(shí)” 體外免疫法 “操作繁瑣”免疫途徑：皮下注射腹腔注射靜脈注射抗體制藥主題醫(yī)學(xué)知識(shí)32第二節(jié) 單克隆抗體及其制備常用免疫方法： 常規(guī)免疫法 第二節(jié) 單克隆抗體及其制備常規(guī)免疫法：抗體制藥主題醫(yī)學(xué)知識(shí)3

12、3第二節(jié) 單克隆抗體及其制備常規(guī)免疫法：抗體制藥主題醫(yī)學(xué)知識(shí)3第二節(jié) 單克隆抗體及其制備脾內(nèi)免疫法： 脾內(nèi)免疫法即在麻醉?xiàng)l件下直接把0.10.2ml的抗原注入脾臟進(jìn)行免疫。脾內(nèi)免疫法可提高小鼠對(duì)抗原的免疫反應(yīng)，節(jié)省抗原用量，細(xì)胞抗原只需105個(gè)左右，可溶性抗原只需10g左右?？贵w制藥主題醫(yī)學(xué)知識(shí)34第二節(jié) 單克隆抗體及其制備脾內(nèi)免疫法： 脾內(nèi)免抗體制藥主題醫(yī)學(xué)知識(shí)培訓(xùn)課件第二節(jié) 單克隆抗體及其制備二、細(xì)胞融合與雜交瘤細(xì)胞的選擇細(xì)胞融合方法： 病毒介導(dǎo)的細(xì)胞融合 PEG 介導(dǎo)細(xì)胞融合 電極融合抗體制藥主題醫(yī)學(xué)知識(shí)36第二節(jié) 單克隆抗體及其制備二、細(xì)胞融合與雜交瘤細(xì)胞的選擇細(xì)胞第二節(jié) 單克隆抗體及

13、其制備細(xì)胞懸液的制備與融合 脾細(xì)胞懸液的制備：最后一次免疫后第3天制備 骨髓瘤細(xì)胞懸液的制備： 于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期制備 細(xì)胞融合：5% PEG （10004000），pH8.0， 38， 1min 抗體制藥主題醫(yī)學(xué)知識(shí)37第二節(jié) 單克隆抗體及其制備細(xì)胞懸液的制備與融合 脾細(xì)胞懸液第二節(jié) 單克隆抗體及其制備2. HAT培養(yǎng)基的篩選融合后細(xì)胞混合液HAT培養(yǎng)基HT培養(yǎng)基正常培養(yǎng)基2 weeks later1 week later抗體制藥主題醫(yī)學(xué)知識(shí)38第二節(jié) 單克隆抗體及其制備2. HAT培養(yǎng)基的篩選融合后細(xì)胞第二節(jié) 單克隆抗體及其制備三、篩選陽(yáng)性克隆與克隆化常用方法：要求： 簡(jiǎn)便、快速、敏感； 在短時(shí)

14、間能檢測(cè)大量樣品 酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay， ELISA）間接免疫熒光法（Indirect immunofluorescence， IFA） 放射免疫法（radioimmunoassay， RIA）雙向擴(kuò)散法抗體制藥主題醫(yī)學(xué)知識(shí)39第二節(jié) 單克隆抗體及其制備三、篩選陽(yáng)性克隆與克隆化常用方法：第二節(jié) 單克隆抗體及其制備酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）技術(shù)原理：抗體制藥主題醫(yī)學(xué)知識(shí)40第二節(jié) 單克隆抗體及其制備酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）技術(shù)原第二節(jié) 單克隆抗體及其制備四、克隆化常用克隆化方法：有限稀釋法軟瓊脂平板法顯微操作法 80 個(gè)細(xì)/96

15、孔飼養(yǎng)細(xì)胞（feeder cells） ELISA 法檢測(cè)單克隆雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)上清，選出分泌特異性抗體的陽(yáng)性孔，所分泌抗體即為單克隆抗體?？贵w制藥主題醫(yī)學(xué)知識(shí)41第二節(jié) 單克隆抗體及其制備四、克隆化常用克隆化方法：有限稀釋第二節(jié) 單克隆抗體及其制備單克隆抗體（monoclonal antibody，MAb）由單一克隆的雜交瘤細(xì)胞分泌的抗體，只針對(duì)于一個(gè)抗原決定簇-單克隆抗體（monoclonal antibody， MAb）單克隆抗體優(yōu)點(diǎn)：高度純一高度專(zhuān)一應(yīng)用： 疾病的論斷和治療（生物導(dǎo)彈） 生物大分子的鑒定、定位和分離純化 細(xì)胞器的鑒定、定位和分離 特定細(xì)胞或病毒的鑒定、定位很分離抗體制藥

16、主題醫(yī)學(xué)知識(shí)42第二節(jié) 單克隆抗體及其制備單克隆抗體（monoclonal 第二節(jié) 單克隆抗體及其制備五、單克隆抗體的大量制備常用的大規(guī)模培養(yǎng)方法：動(dòng)物接種法轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)法細(xì)胞培養(yǎng)罐法抗體制藥主題醫(yī)學(xué)知識(shí)43第二節(jié) 單克隆抗體及其制備五、單克隆抗體的大量制備常用的大規(guī)第二節(jié) 單克隆抗體及其制備五、單克隆抗體的大量制備大量制備單克隆抗體的方法主要有兩種： 體外培養(yǎng)法：10g/ml 動(dòng)物體內(nèi)誘生法：520mg/mlBALB/c小鼠優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)便，比較經(jīng)濟(jì)，所得單克隆抗體較多且效價(jià)較高。缺點(diǎn)：混有雜蛋白有血清培養(yǎng)法；無(wú)血清培養(yǎng)法抗體制藥主題醫(yī)學(xué)知識(shí)44第二節(jié) 單克隆抗體及其制備五、單克隆抗體的大量制備大量制備單第二節(jié) 單克隆抗體及其制備抗體制藥主題醫(yī)學(xué)知識(shí)45第二節(jié) 單克隆抗體及其制備抗體制藥主題醫(yī)學(xué)知識(shí)45第二節(jié) 單克隆抗體及其制備動(dòng)物接種法轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)法細(xì)胞培養(yǎng)罐法抗體制藥主題醫(yī)學(xué)知識(shí)46第二節(jié) 單克隆抗體及其制備動(dòng)物接種法抗體制藥主題醫(yī)學(xué)知