畢業(yè)論文-冷脅迫條件下不同玉米自交系脂肪酸及其相關(guān)基因的表達(dá)分析

1、本科生畢業(yè)論文（設(shè)計）中文題目 冷脅迫條件下不同玉米自交系脂肪酸及其相關(guān)基 因的表達(dá)分析英文題目Expression of fatty acids and related genes in different maize inbred lines under cold stress 學(xué)生姓名 班級 學(xué) 院 植物科學(xué)學(xué)院 專 業(yè) 生物技術(shù)（植物） 指導(dǎo)教師 職稱 講師 中文摘要冷脅迫條件下不同玉米自交系脂肪酸及其相關(guān)基 因的表達(dá)分析玉米（Zea mays L.)為禾本科，玉蜀黍一年生草本C4植物，起源于熱帶或亞熱帶地區(qū)。是目前我國的第一糧食作物，種植面積大，應(yīng)用范圍廣。在滿足我國巨大人口的糧食需

2、求的同時，又為化工，燃料，醫(yī)藥等行業(yè)提供了重要的原料，因此，玉米的種植及玉米種質(zhì)的培養(yǎng)和研究在近年來，顯得越發(fā)重要。由于玉米的起源地氣候?qū)贉囟容^高原因，以及我國大部分地區(qū)氣溫較低，導(dǎo)致玉米在我國的種植，極易受到低溫影響而導(dǎo)致產(chǎn)量驟減。所以，研究玉米冷響應(yīng)機(jī)理，培育抗冷高產(chǎn)玉米品種具有重要的經(jīng)濟(jì)現(xiàn)實意義。本研究從玉米冷處理條件下脂肪酸含量及脂肪酸相關(guān)基因表達(dá)等方面，研究分析了兩個不同玉米自交系W9816和B73的特征。通過形態(tài)學(xué)比較，W9816在冷處理后受傷害程度較輕而B73萎蔫嚴(yán)重。脂肪酸成分分析結(jié)果表明，冷處理后W9816中亞麻酸（18：3）含量下降相對較少，而異油酸（18：1）、亞油酸（1

3、8：2）較B73增加更多。綜合植物生理學(xué)，分子生物學(xué)等證據(jù)表明不同玉米自交系可能有不一樣的冷響應(yīng)途徑。關(guān)鍵詞：玉米，低溫冷害，脂肪酸 AbstractAnalysis of fatty acids and their related genes in Maize Inbred Lines under cold stress Maize (Zea mays L.) for grass, corn annuals C4 plants originated in tropical or subtropical regions. It is the first grain crop in our co

4、untry, which has large area and wide application. To meet Chinas huge population at the same time, but also for the chemical industry, fuel, pharmaceutical and other industries provide important raw materials, therefore, planting and cultivation of Maize Germplasm and research in recent years, it be

5、comes more and more important. Due to the origin of the climate of maize is a high temperature causes, as well as low temperatures in most parts of our country, resulting in the cultivation of corn in China, easily affected by low temperature, resulting in a sharp decline in production. Therefore, i

6、t is of great practical significance to study the mechanism of cold response of maize, and to develop cold resistant and High-yield Maize varieties.In this study, we analyzed the characteristics of two maize inbred lines, W9816 and B73, from the aspects of fatty acid content and fatty acid related g

7、ene expression. By morphological comparison, W9816 was slightly damaged after cold treatment, but B73 was wilting. The analysis of fatty acid composition showed that the content of linolenic acid (18:3) in W9816 was relatively less after cold treatment, and the difference between oleic acid (18:1) a

8、nd linoleic acid (18:2) was more than that of B73. Comprehensive plant physiology, molecular biology and other evidence show that different maize inbred lines have different cold response pathways.Key words：maize，cold stress， HYPERLINK /link?url=JHD5inb1SnAF6LOxTdNrJrzeAIRqpmGC4B1n0go865ABqful5nK6VK

9、sY89ioNvqGnWK5xhvvkU69hN4TuM3-f3iioptNF6YbTISssmzoATy&wd=&eqid=896479af000604940000000359144a29 t /_blank delspray 第1章 前言玉米（Zea mays )為禾本科，起源于熱帶或亞熱帶，是玉蜀黍一年生高大草本C4植物.用途廣泛，產(chǎn)量高，是目前我國種植面積最大產(chǎn)量最高的糧食作物，其廣泛的用途涉及醫(yī)藥，化工，燃料和食品等多個領(lǐng)域，且扮演著重要角色。因此玉米是一種地位高，需求高，作用巨大的農(nóng)作物。但是由于起源于溫度較高地區(qū)，導(dǎo)致玉米對低溫冷害的抵抗能力很低，在其從幼苗期開始的整個生長周期過

10、程中，都極其容易受到低溫冷害的影響而導(dǎo)致減產(chǎn)甚至絕產(chǎn)。而中國大面積種植耕地座落在低溫氣候易發(fā)生地區(qū)，這種情況嚴(yán)重限制了玉米的種植和產(chǎn)量。尤其是東北地區(qū)，作為中國一個重要的糧食生產(chǎn)基地，四季鮮明尤其是早春低溫氣候漫長，導(dǎo)致低溫冷害時常發(fā)生，嚴(yán)重制約了糧食特別是玉米這種喜溫作物的生長。因此，對玉米冷響應(yīng)機(jī)制及抵抗低溫冷害機(jī)理的研究便具有極其重要的現(xiàn)實意義及經(jīng)濟(jì)意義，玉米抗冷性的研究將帶動整個東北地區(qū)的糧食產(chǎn)量和經(jīng)濟(jì)進(jìn)步。玉米的低溫冷害1.1 什么是低溫冷害低溫冷害一般指在0-20的溫度間，此溫度低于其生長發(fā)育所需的 HYPERLINK /item/%E7%8E%AF%E5%A2%83%E6%B8%

11、A9%E5%BA%A6 t /_blank 環(huán)境溫度，引起 HYPERLINK /item/%E5%86%9C%E4%BD%9C%E7%89%A9 t /_blank 農(nóng)作物生育期延遲，或使其生殖器官的生理機(jī)能受到損害，導(dǎo)致農(nóng)業(yè)減產(chǎn)。簡稱冷害。根據(jù)農(nóng)業(yè)氣象學(xué)將玉米冷害分為延遲型冷害、障礙型冷害和混合型冷害。東北地區(qū)玉米的冷害通常是發(fā)生在苗期的延遲性冷害。延遲型冷害指玉米由于生長季中溫度偏低，發(fā)育期延遲致使玉米在霜凍前不能正常成熟，籽粒含水量增加，千粒重下降，最終造成玉米籽粒產(chǎn)量下降。苗期低溫降低了光合作用強(qiáng)度，影響植株生長。即使溫度恢復(fù)后仍有一定的低溫后效作用，然后逐漸恢復(fù)。同時，低溫下植株功

12、能葉片的生長受到抑制，影響了植株總的有效葉面積，致光合生產(chǎn)率下降。播種至出苗期需有效積溫794日度，生物學(xué)低限為93。播種至出苗的天數(shù)隨溫度增高而縮短。平均氣溫15，需1520天。平均氣溫12.8168產(chǎn)量高，高于或低于這個溫度都會減產(chǎn)。均溫低于10，光合生產(chǎn)率明顯下降。生產(chǎn)上播種至出苗平均氣溫升高或降低1，每667m2產(chǎn)量就會增加或減少106kg。我國東北地區(qū)，地處偏寒，冷害成為東北地區(qū)主要的農(nóng)業(yè)災(zāi)害之一，發(fā)生頻繁且破壞嚴(yán)重。在早春季節(jié)，玉米播種出苗之后時常發(fā)生溫度下降甚至驟降的情況，農(nóng)民往往需要做大量的工作來預(yù)防或者對抗隨之而來的低溫冷害，一旦工作疏忽或者降溫氣候來勢洶洶，就會導(dǎo)致玉米大面

13、積減產(chǎn)。作為三大黃金玉米帶所在地的東北，在遭遇低溫冷害時，玉米單位面積減產(chǎn)量達(dá)10%以上。勉強(qiáng)存貨的玉米幼苗也會出現(xiàn)苗弱，瘦小甚至萎蔫的情況，導(dǎo)致產(chǎn)出玉米品質(zhì)下降。冷脅迫已經(jīng)成為限制東北地區(qū)玉米產(chǎn)量的主要非生物脅迫之一。隨著對玉米需求量的加大,以及國外品種的進(jìn)入,如何選育出強(qiáng)優(yōu)勢玉米雜交種,提高玉米產(chǎn)量成為當(dāng)務(wù)之急。1.2 脂肪酸與冷響應(yīng)機(jī)制脂肪酸（fatty acid），是指一端含有一個 HYPERLINK /item/%E7%BE%A7%E5%9F%BA t /_blank 羧基的長的脂肪族碳?xì)滏湥怯袡C(jī)物，直鏈飽和脂肪酸的通式是C(n)H(2n+ 1)COOH，低級的脂肪酸是無色液體，有

14、刺激性氣味，高級的脂肪酸是蠟狀固體，無可明顯嗅到的氣味。脂肪酸是最簡單的一種脂，它是許多更復(fù)雜的脂的組成成分。脂肪酸在有充足 HYPERLINK /item/%E6%B0%A7/83765 t /_blank 氧供給的情況下，可氧化分解為CO2和H2O，釋放大量能量，因此脂肪酸是機(jī)體主要能量來源之一。大多數(shù)脂肪酸含偶數(shù)碳原子，因為它們通常從2碳單位生物合成。高等動、植物最豐富的脂肪酸含16或18個碳原子，如棕櫚酸（軟脂酸）、油酸、亞油酸和 HYPERLINK /item/%E7%A1%AC%E8%84%82%E9%85%B8 t /_blank 硬脂酸。不飽和脂肪酸必有1個雙鍵在C和C之間（從

15、羧基碳原子數(shù)起）。脂肪酸的雙鍵幾乎總是順式幾何構(gòu)型，這使不飽和脂肪酸的烴鏈有約30的彎曲，干擾它們堆積時有效地填滿空間，結(jié)果降低了范德華相互反應(yīng)力，使脂肪酸的熔點隨其不飽和度增加而降低。脂質(zhì)的流動性隨其脂肪酸成分的不飽和度相應(yīng)增加，這個現(xiàn)象對膜的性質(zhì)有重要影響。飽和脂肪酸是非常柔韌的分子，理論上圍繞每個CC鍵都能相對自由地旋轉(zhuǎn)，因而有的構(gòu)像范圍很廣。但是，其充分伸展的構(gòu)象具有的能量最小，也最穩(wěn)定；因為這種構(gòu)象在毗鄰的亞甲基間的位阻最小。和大多數(shù)物質(zhì)一樣，飽和脂肪酸的熔點隨分子重量的增加而增加。御冷性強(qiáng)的植物細(xì)胞含有較多的不飽和脂肪酸、磷脂和甾類物質(zhì)，使膜脂在低溫下仍處于流體狀態(tài)，并維持較高的酶

16、含量和酶活力，以保持植物代謝和膜系統(tǒng)的穩(wěn)定狀態(tài)。耐冷性主要是組織內(nèi)具有高還原力，能防止膜脂過氧化和蛋白質(zhì)變性和聚合；膜蛋白多，能修復(fù)失活的離子泵。膜蛋白構(gòu)象，膜脂的脂肪酸組成和激素調(diào)節(jié)也在抗冷性中起重要作用。不飽和脂肪酸是生物膜功能所必須的。當(dāng)催化不飽和脂肪酸 合成的酶發(fā)生突變時，植物體內(nèi)不飽和脂肪酸減少，抗寒性減弱，國外Ssreerville和Browse以擬南芥為材料，對擬南芥葉綠體sn-2-棕櫚酰去飽和酶和12-去飽和酶基因突變體fad5和fad6，在低溫下葉片黃化，生長緩慢，葉綠體形成也發(fā)生改變，同樣其微粒體12-去飽和酶基因突變體fad2的耐低溫能力也減弱。這表明不飽和脂肪酸在植物幼

17、苗抗冷耐寒中擔(dān)任重要角色，對培育抗寒品種起著重要作用。同時大量實驗證明，生物膜脂地不飽和度與植物的耐冷性密切相關(guān)，膜脂不飽和脂肪酸含量升高，膜脂相變溫度降低，增加了膜地流動性，從而使植物的抗冷性相應(yīng)提高。反之，冷敏感植物膜脂脂肪酸的不飽和度低，低溫下膜脂由液晶相向凝膠相轉(zhuǎn)變，造成細(xì)胞膜膜相分離，從而引起細(xì)胞代謝紊亂。在所有膜系統(tǒng)中葉綠體類囊體膜脂的多不飽和脂肪酸含量最高，亞麻酸和十六碳三烯酸等三烯脂肪酸含量達(dá)80%對維持地問下葉綠體膜流動性及其穩(wěn)定性具有重要作用，并且冷適應(yīng)過程中三烯脂肪酸的增加是低溫條件下葉片正常生長的重要前提之一。目前認(rèn)為低溫調(diào)節(jié)生物膜膜脂脂肪酸去飽和的分子機(jī)制是：調(diào)節(jié)FA

18、D的表達(dá)，從而改變酶蛋白數(shù)量；翻譯后水平調(diào)節(jié)FAD活性；改變可用的底物調(diào)節(jié)FAD火星。大量實驗結(jié)果證實，膜脂脂肪酸不飽和度主要取決于FAD的種類和數(shù)量，通過酶的種類和活性的變化，調(diào)節(jié)膜脂的不飽和度，進(jìn)而改變其流動性，以適應(yīng)外界的溫度變化。1.3研究意義及目的 1.玉米是重要的糧食作物玉米適應(yīng)性強(qiáng)，分布廣，用途多，增產(chǎn)潛力大，在全世界播種面積和總產(chǎn)量僅次于水稻和小麥，居第三位，發(fā)展速度很快。玉米作為重要的糧食作物，還表現(xiàn)在含有較豐富的營養(yǎng)物質(zhì)。每500克玉米子粒含碳水化合物365克，略低于水稻；脂肪含量21.5克，超過其它任何谷類作物；蛋白質(zhì)42.5克，僅次于小米；維生素B2則高于其它作物。玉米

19、含有較多的纖維素和多種維生素。2.玉米是高產(chǎn)作物光合作用效率較高，玉米是利用雜種優(yōu)勢最早、最好的作物；國內(nèi)外專家研究認(rèn)為，從群體光合結(jié)構(gòu)看，玉米是作物中株型最為理想的作物，為高產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)并占有絕對優(yōu)勢，已經(jīng)被生產(chǎn)實踐所證明。3玉米是優(yōu)質(zhì)飼料玉米的籽粒是家畜、家禽的上等精飼料，對提高豬肉、牛乳和蛋類產(chǎn)品的產(chǎn)量和品質(zhì)有顯著作用。玉米莖葉含有豐富的維生素，乳熟到蠟熟期收獲的鮮莖葉和果穗，鍘碎可做青貯飼料?？v觀世界上一些畜牧業(yè)發(fā)達(dá)的國家，無不是以發(fā)展玉米起家的，各國畜牧業(yè)最發(fā)達(dá)的地區(qū)，大都是玉米集中產(chǎn)區(qū)。4玉米是重要的工業(yè)原料利用玉米子粒和副產(chǎn)品直接或間接制成的工業(yè)產(chǎn)品已達(dá)500種以上?，F(xiàn)代玉米工業(yè)

20、主要產(chǎn)品為玉米淀粉，被廣泛用于食品、醫(yī)藥、紡織等工業(yè)部門。玉米籽粒還可制造葡萄糖、果脯糖漿、白酒、啤酒、丙酮等。玉米的莖稈可制造纖維板、紙張、人造絲、電器絕緣體和化學(xué)膠板等。穗軸可以提取16.5-19%的糖醛，它是制造高級塑料的重要原料。玉米苞葉可編織成提籃、座墊、嬰兒臥具等工藝品。玉米在醫(yī)藥上也有廣泛的用途。玉米淀粉是制造青霉素、鏈霉素、金霉素等抗生菌的重要原料，玉米油含有大量維生素E，具有治療高血壓和血管硬化的作用，是良好的保健食用油。穗軸可制造消毒品及麻醉劑，花絲可醫(yī)治膽囊炎、膽結(jié)石、黃疸肝炎等病，還具有利尿功能。由此可見，玉米產(chǎn)量高，用途廣，因此發(fā)展玉米生產(chǎn)，對改善人民生活，發(fā)展農(nóng)村經(jīng)

21、濟(jì)都具有十分重要的意義.1.4 研究思路及方法玉米受低溫冷害時，葉片為直接也是主要受損部位，因此葉片脂肪酸含量變化為主要指標(biāo)。受低溫冷害主要時期為玉米幼苗期，本實驗研究主方向定位于研究處理幼苗期玉米，并對玉米葉片脂肪酸含量進(jìn)行檢測鑒定和比較。并對脂肪酸含量情況進(jìn)行分析預(yù)測，進(jìn)一步對處理后玉米葉片脂肪酸含量變化進(jìn)行分析比較，以此得到玉米冷響應(yīng)途徑與玉米葉片脂肪酸含量的確切證據(jù)，。具體分析包括對玉米葉片內(nèi)總脂肪酸比較分析，以及對玉米葉片內(nèi)單個種類脂肪酸的比較分析。第2章實驗研究第1節(jié) 實驗材料與實驗儀器1.1 實驗材料 本實驗以玉米自交系B73和W9816為主要研究實驗材料，以W9816為本實驗室

22、篩選得到的耐冷玉米自交系，B73作為對照。1.2 實驗試劑 蒸餾水、無水乙醇、正己烷、氫氧化鉀、三氟化硼、液氮、甲醇等均為國產(chǎn)分析純試劑1.3 實驗儀器 光照培養(yǎng)箱、鑷子、鋼珠研磨機(jī)、水浴鍋、離心機(jī)、超聲提取儀、安捷倫5975氣質(zhì)聯(lián)用儀、氮吹濃縮儀、抽濾裝置、玻璃棒、濾紙、燒杯、試管第2節(jié) 實驗方法2.1 超聲提取超聲波提取是因為超聲波本身具有一定的效應(yīng)，比如機(jī)械，空化和熱等效應(yīng)。利用超聲波具有的這些效應(yīng)，來加大介質(zhì)分子的運(yùn)動速度、增加介質(zhì)的穿透力以達(dá)到提取生物有效成分的目的。機(jī)械效應(yīng)在介質(zhì)中，超聲波的傳播使得介質(zhì)的質(zhì)點在這個傳播空間中，產(chǎn)生振動，而這種振動可以強(qiáng)化介質(zhì)，使介質(zhì)的擴(kuò)散和傳播速度

23、更快，力量更大，這就是超聲波本身所具有的機(jī)械效應(yīng)。超聲波在傳播過程會產(chǎn)生一種具有強(qiáng)大破壞力的壓強(qiáng)，這種壓強(qiáng)叫做輻射壓強(qiáng)，他的傳播方向與聲波相同。輻射壓強(qiáng)可以使細(xì)胞組織發(fā)生變形，使植物蛋白發(fā)生變性；與此同時，它的存在使介質(zhì)和懸浮體具有了不同的加速度，使介質(zhì)分子的運(yùn)動速度遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于懸浮體分子的運(yùn)動速度。運(yùn)動速度不同的介質(zhì)和懸浮體產(chǎn)生劇烈摩擦，這種摩擦使得生物分子被解聚，細(xì)胞壁上的某些有效成分因解聚而從細(xì)胞壁中解下溶解于溶劑中。空化效應(yīng)一般情況下，在介質(zhì)內(nèi)部都會存在多多少少的溶解于其中的微氣泡，而這些微氣泡在超聲波的帶動下，會產(chǎn)生振動，當(dāng)聲壓達(dá)到一定數(shù)值的時候，這些微氣泡會由于聲壓的原因而發(fā)生定向擴(kuò)散

24、。定向擴(kuò)散會使得氣泡增大而產(chǎn)生共振腔，然后共振腔會突然閉合，這就是超聲波所具有的空化效應(yīng)。這些微氣泡在閉合時，其周圍會產(chǎn)生數(shù)千個大氣壓的壓力，形成微激波，微激波可以使植物細(xì)胞細(xì)胞壁以及整個生物體破裂，并且，整個破裂過程是在極短的時間內(nèi)完成的，使細(xì)胞內(nèi)有效成分更快速完整的溶出。熱效應(yīng)超聲波具有和其他物理波一樣的性質(zhì)，在介質(zhì)中傳播時，這個傳播過程是一個能量的傳播和擴(kuò)散過程。而在這個傳播過程，介質(zhì)中的質(zhì)點將吸收超聲波的聲能，被吸收的聲能，將被介質(zhì)全部或者絕大部分轉(zhuǎn)化為熱能，轉(zhuǎn)化產(chǎn)生的熱能將使介質(zhì)本身和植物組織的溫度升高，溫度的升高有助于植物組織內(nèi)有效成分的溶解，在一定條件下溫度越高溶解速度越快。因為

25、超聲波能量轉(zhuǎn)化引起的植物組織內(nèi)部溫度升高是在極短時間內(nèi)完成的，所以植物組織內(nèi)的提取物生物活性將被最大限度地保存。2.2 氮氣濃縮使用氮吹儀將氮氣吹出，使氮氣經(jīng)過被加熱的樣品的表面，氮氣的經(jīng)過將會使得樣品中溶劑十分迅速地蒸發(fā)和分離，樣品就可以得到藥效濃縮。又因為全程由氮氣參與，可以達(dá)到無氧的目的，使?jié)饪s得到的樣品更加純凈。同時，使用氮吹儀的好處是，較傳統(tǒng)常用的旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀而言，氮吹儀能同時濃縮多個樣品，大大縮短實驗濃縮所需時間，具有省時省事，操作簡單快捷等優(yōu)點。2.3 gc-mcgc：惰性氣體如氦氣等將作為氣相色譜的流動相， HYPERLINK /item/%E6%B0%94-%E5%9B%BA%

26、E8%89%B2%E8%B0%B1%E6%B3%95 t /_blank 氣-固色譜法中，表面積比較大并且具有活性良好的吸附劑是作為固定相的首選。將含有多種組分的混合樣品通過色譜柱時，因為吸附劑對于每個成分的吸附能力有所不同，因此不同組分在色譜柱中運(yùn)動一定時間后，各組分在色譜柱中便會因受吸附力影響不同而各自具有了不同的運(yùn)動速度。受到的吸附作用比較弱的組分受到束縛作用較弱，較其他組分而言更加容易被解吸下來，因此較早離開色譜柱，而吸附力最強(qiáng)的組分受到強(qiáng)大束縛效果，最不容易被解吸，因此最后離開色譜柱。如此，屬性不同的組分在色譜柱中彼此得到分離，依照一定運(yùn)動順序進(jìn)入檢測器中進(jìn)行檢測。mc：質(zhì)譜分析是一

27、種用來測量離子荷質(zhì)比的主要分析方法，其基本原理 是將樣本中各組分通過離子源并在離子源中發(fā)生電離，變成具有不同荷質(zhì)比的正電荷的離子，使離子通過加速電場，經(jīng)加速電場的加速作用，形成具有不同運(yùn)動速度的離子束，進(jìn)入特定質(zhì)量分析器。在質(zhì)量分析器中，再利用電場和磁場的共同疊加作用，使進(jìn)入其中的離子束產(chǎn)生相反的速度色散，將它們分別進(jìn)行聚焦從而得到實驗所需的質(zhì)譜圖，最后通過質(zhì)譜圖來確定其質(zhì)量。氣相色譜法質(zhì)譜法聯(lián)用（GC-MS)是一種同時具有氣相色譜和質(zhì)譜的特性，能將樣本中不同物質(zhì)鑒定出來的方法。 其作用應(yīng)用涉及工業(yè)檢測、食品安全、環(huán)境保護(hù)等眾多不同領(lǐng)域。第3節(jié) 實驗研究3.1 玉米培養(yǎng)基質(zhì)土的配制配置玉米營養(yǎng)

28、基質(zhì)土的要求，首先要保證基質(zhì)土的營養(yǎng)，要保證營養(yǎng)土中含有大量有機(jī)質(zhì)，其含量大于或等于30%。其次，要保證土質(zhì)疏松，保證透氣，總空隙不低于60%，同時保水保肥性能良好。在保證土質(zhì)的基本條件同時，基質(zhì)土的元素含量也非常重要，大量元素和微量元素含量合理且協(xié)調(diào)對玉米生長十分重要。除以上重要條件外，土應(yīng)保證潔凈，物理性狀良好。3.2玉米材料的培養(yǎng)與處理 選擇等數(shù)量W9816、B73的玉米種子，要求種子發(fā)育良好子葉肥厚胚乳完整，確保出苗率。將選擇的種子，使用蒸餾水于室溫下在燒杯中浸泡24小時。浸泡24小時結(jié)束后，將處理好的種子種植于盛有已經(jīng)配置好的基質(zhì)土的營養(yǎng)缽中。將玉米培養(yǎng)至幼苗期，待幼苗期玉米達(dá)到三葉

29、一心期。將營養(yǎng)缽放入人工氣候箱中，調(diào)節(jié)人工氣候箱條件為，溫度16/14（day/night），相對濕度60/70%（day/night），光周期16/18小事，光強(qiáng)度450mol/，處理時長為10天。3.3 處理后幼苗分析 對16處理10天后的玉米幼苗進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察分析，將處理后幼苗與未經(jīng)低溫處理幼苗進(jìn)行整株形態(tài)學(xué)比較，再將玉米幼苗的第3、4片葉片剪下，置于干凈濾紙上進(jìn)行比較觀察。3.4 玉米葉片脂肪酸提?。?）將上述中處理后玉米幼苗葉片取下，準(zhǔn)確稱取1.5g玉米葉片樣本，并迅速置于液氮中，防止離體玉米葉片材料內(nèi)脂肪酸含量因外界環(huán)境而發(fā)生變化。將液氮冷凍后的玉米葉片樣本于液氮條件下快速并充分研

30、磨成粉末狀。（2）將研磨后的粉末狀樣品中加入10ml無水乙醇，用玻璃棒攪拌以達(dá)到充分混勻的目的，使乙醇與樣品充分接觸。將樣品放入水浴鍋中，調(diào)節(jié)水浴鍋溫度為50，保持水浴60min，多次觀察并攪拌樣品。（3）將水浴過后的試驗樣品進(jìn)行超聲提取，超聲條件為500W，時間為60min，以達(dá)到提取充分的目的。提取后利用抽濾裝置，對固液混合樣本進(jìn)行抽濾使葉片殘渣和液體提取液分離。（4）將充分分離后的提取液進(jìn)行氮吹濃縮，得到濃縮后的樣本。（5）甲酯化：由于脂肪酸沸點較高，在進(jìn)行GC-MC測定是，樣本不穩(wěn)定會影響實驗的準(zhǔn)確性，因此需要對樣本進(jìn)行處理，使脂肪酸甲酯化以降低沸點增加穩(wěn)定性。甲酯化具體操作為，氮吹濃

31、縮后的樣本首先加入2ml正己烷，然后加入濃度為2mol氫氧化鉀-甲醇溶液，劇烈震蕩2min，將震蕩后樣本放入30水浴鍋中水浴反應(yīng)，水浴時間為20min。（6）分離：水浴后樣本中的脂肪酸基本甲基化，此時需要將甲基化的脂肪酸進(jìn)行分離，采用分液萃取法，在甲基化后的樣本中加入2ml三氟化硼-甲醇溶液。進(jìn)行離心分離，在3000r/min條件下離心分離10min，離心后取上清液即為實驗所需脂肪酸。3.5 脂肪酸的測定 將提取后的脂肪酸含量進(jìn)行測定。利用GC-MS進(jìn)行測定，本實驗采用安捷倫5975氣質(zhì)聯(lián)用儀，設(shè)定氣質(zhì)聯(lián)用儀氣相條件：設(shè)定進(jìn)樣口溫度為250，起始溫度為100并且使其以每分鐘10的速度升到170

32、，保持170一分鐘后，一3每分鐘的速度將溫度提升到250，保持此溫度4分鐘。設(shè)定流速：設(shè)定為2.4ml每分鐘，采用恒流模式，流進(jìn)樣分流比為50：1.由此得到色譜圖和質(zhì)譜圖。得到的質(zhì)譜圖根據(jù)質(zhì)譜圖鑒即可得到樣本中所含脂肪酸種類，得到的色譜圖可以利用本儀器中的標(biāo)準(zhǔn)圖譜庫進(jìn)行檢索，結(jié)合色譜峰及質(zhì)譜圖的相應(yīng)數(shù)據(jù)，利用系統(tǒng)軟件進(jìn)行處理，計算得到各種脂肪酸及總脂肪酸含量。第3章 實驗結(jié)果及分析第1節(jié)脂肪酸含量結(jié)果1.1 處理前后不同品種各脂肪酸含量有此實驗得到樣本內(nèi)各脂肪酸含量如表1-1冷脅迫下不同玉米葉片脂肪酸含量比較 表1-1將表1-1制成柱狀圖1-2，各種脂肪酸在兩種玉米自交系以及兩種不同處理條件的

33、實驗材料中的含量。圖1-3，為不飽和脂肪酸在不同玉米自交系中的表達(dá)情況。橫坐標(biāo)為不同玉米自交系材料，以及兩種不同處理條件?？v坐標(biāo)為在各自材料中不飽和脂肪酸含量數(shù)值。圖1-4，為不飽和脂肪酸，含三個不飽和鍵的脂肪酸含量圖表。橫坐標(biāo)為相關(guān)玉米自交系種類。縱坐標(biāo)為對應(yīng)的18：3不飽和脂肪酸含量數(shù)值。第2節(jié) 結(jié)果分析 2.1 形態(tài)學(xué)結(jié)果分析實驗發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過16處理后的玉米植株發(fā)紅發(fā)紫，葉面邊緣出現(xiàn)不同程度萎蔫。而W9816與B73兩個品種相比較而言，品種W9816即耐冷自交系傷害程度較低，花青素積累相對較少。 2.2脂肪酸結(jié)果分析經(jīng)過實驗得到對照及處理樣本中的脂肪酸含量及其變化后數(shù)據(jù)?？芍?，總脂肪酸含量

34、對比結(jié)果，處理前自交系品種W9816總脂肪酸含量略高，而處理后其總脂肪酸含量要略低，雖然總脂肪酸含量多少在經(jīng)過16處理后發(fā)生變化，但是變化并不顯著，因此總脂肪酸含量并不能作為玉米抗寒品種的有效證明。在利用氣質(zhì)聯(lián)用儀對各種單種類脂肪酸含量進(jìn)行測定比較后，如圖（1-2、1-3、1-4）得到分析結(jié)果。兩個樣本中，棕櫚酸（16：0）的百分比含量均上升。硬脂酸（18：0）含量，在B73中經(jīng)低溫處理后出現(xiàn)增加情況，而在品種W9816中則是對照組含量較高。此外的三種不飽和脂肪酸變化情況各不相同。異油酸（18：1）、亞油酸（18：2）在兩個玉米品種中，經(jīng)過冷處理均出現(xiàn)含量增加的情況。而亞麻酸（18：3）則出現(xiàn)

35、了含量下降的現(xiàn)象，在B73和W9816中下降幅度分別達(dá)到3.25%和2.43%。顯然在W9816中這種下降較B73是幅度較小的。而品種W9816中（18：3）在處理前含量最高。由此結(jié)果我們可以推斷，玉米幼苗抵抗低溫冷害能力與不飽和脂肪酸含量相關(guān)，不飽和脂肪酸含量較高則抗冷性較強(qiáng)。在不飽和脂肪酸中，這種抗寒能力與鍵的多少成正比。含鍵多的脂肪酸種類含量較高則可能具有更強(qiáng)的抵抗寒冷的能力。2.3 基因表達(dá)分析在經(jīng)過對與脂肪酸合成相關(guān)的基因的研究后，我們得到lox基因即脂氧合酶基因的表達(dá)數(shù)據(jù)，如圖2-1圖2-1由圖2-1制作得表2-1-1圖1-2，lox脂氧合酶基因表達(dá)柱狀圖，橫坐標(biāo)為樣本種類，即兩種

36、玉米自交系，以及各自兩種處理條件?？v坐標(biāo)為基因表達(dá)情況數(shù)值，通過計算得出。結(jié)論經(jīng)過實驗研究以及對實驗結(jié)果比較分析得到研究結(jié)論，寒冷低溫條件將會引起玉米體內(nèi)脂肪酸含量變化，而這種變化將有助于玉米抵抗低溫寒冷的惡劣條件。研究得知玉米抗冷性與玉米內(nèi)脂肪酸含量有關(guān)，且與不飽和脂肪酸含量成正相關(guān)，尤其是不飽和脂肪酸中的多不飽和脂肪酸，其含量越高將越有助于玉米抵抗低溫冷害等自然災(zāi)害。致謝這次的畢業(yè)論文設(shè)計總結(jié)是在我的指導(dǎo)老師李世鵬老師親切關(guān)懷和悉心指導(dǎo)下完成的。從畢業(yè)設(shè)計選題到設(shè)計完成，李老師給予了我耐心指導(dǎo)與細(xì)心關(guān)懷，有了李老師耐心指導(dǎo)與細(xì)心關(guān)懷我才不會在設(shè)計的過程中迷失方向，失去前進(jìn)動力。李老師有嚴(yán)肅

37、的科學(xué)態(tài)度，嚴(yán)謹(jǐn)?shù)闹螌W(xué)精神和精益求精的工作作風(fēng)，這些都是我所需要學(xué)習(xí)的，感謝李老師給予了我這樣一個學(xué)習(xí)機(jī)會，謝謝!感謝與我并肩作戰(zhàn)的舍友與同學(xué)們，感謝關(guān)心我支持我的朋友們，感謝學(xué)校領(lǐng)導(dǎo)、老師們，感謝你們給予我的幫助與關(guān)懷;感謝吉林大學(xué)，特別感謝植物科學(xué)學(xué)院四年來為我提供的良好的生活學(xué)習(xí)環(huán)境，我為吉林大學(xué)驕傲，我為植科院自豪，謝謝!參考文獻(xiàn)1. HYPERLINK /kcms/detail/detail.aspx?filename=SMKX200805034&dbcode=CJFQ&dbname=CJFD2008&v= t /KCMS/detail/kcmstarget 脂肪酸去飽和酶的研究進(jìn)展

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