Apoptin基因誘導(dǎo)A375細胞凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制

1、Apoptin基因誘導(dǎo)A375細胞凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制【關(guān)鍵詞】腫瘤特異性凋亡基因；細胞；凋亡；半胱天冬蛋白酶,摘要：目的研究腫瘤特異性凋亡基因(apptin)在誘導(dǎo)人黑色素瘤細胞A375凋亡中的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制。方法用含有apptin基因的真核表達載體瞬間轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的人黑色素瘤細胞A375；采用RT-PR、DNA凝膠電泳、流式細胞儀分析檢測A375的細胞的凋亡；以比色法檢測半胱天冬蛋白酶8(aspase-8)和aspase-3的相對活性。結(jié)果Apptin基因瞬間傳染的A375細胞可出現(xiàn)典型的細胞凋亡所具有DNA梯狀帶；流式細胞術(shù)發(fā)現(xiàn)實驗組細胞凋亡率明顯高于其他各組(P001)；aspase-3的活

2、性升高，但aspase-8活性沒有明顯變化。結(jié)論Apptin基因可通過激活aspase-3誘導(dǎo)人黑色素瘤細胞A375凋亡。關(guān)鍵詞：腫瘤特異性凋亡基因；細胞；凋亡；半胱天冬蛋白酶StudynsignaltransdutininapptsisfhuanelanaellsA375induedbyapptinLabfleularBilgy,enterfrDiseasentrlandPreventin,Shenyangilitaryand(Shenyang110034,hina)Abstrat：bjetiveTstudyhetherapptingeneinduesapptsisinhuanelanael

3、lsA375viatheativatinaspase-8andaspase-3.ethdsThehuanelanaellsA375eretransientlytransfetedithrebinantpDNAA3plasid,hihntainedapptingene,andtheapptsisaseasuredbyDNAagarseeletrphresis,RT-PRandflytetry.aspase-8andaspase-3relativeativityasanalyzedbylrietriassayatvariustie.ResultsTheapptingeneuldindueappts

4、isfhuanelanaellsA375invitrandtheRNAfapptingeneuldbedetetedbyRT-PR.Theativityfaspase-3begantriseinA375ellsaftertransfetedithapptingene,butthatfaspase-8didnthange.nlusinApptingeneanindueapptsisinhuanelanaellsA375viaativeaspase-3.Keyrds：apptin;ell;apptsis;aspase細胞凋亡是一種機體為維護正常組織形態(tài)、體積及功能而與細胞增殖相平衡的主動自殺過程；

5、凋亡發(fā)生異常，會導(dǎo)致細胞無限增殖而致癌變發(fā)生。在對凋亡機制的研究中，陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了一些誘導(dǎo)細胞凋亡的酶類，其中半胱天冬蛋白酶(aspase)是細胞凋亡的關(guān)鍵分子，細胞凋亡的形態(tài)變化是系列aspase活化并水解底物的結(jié)果。近年來研究發(fā)現(xiàn)，Apptin可通過獨立于p53作用處徑、不被Bl-2過量表達所抑制的方式，特異性誘導(dǎo)人類多種腫瘤細胞和轉(zhuǎn)化細胞的凋亡，但并不作用于正常細胞1，2。本研究前期克隆和構(gòu)建了apptin基因真核表達載體，并證明該載體對人黑素瘤細胞A375具有明顯的凋亡誘導(dǎo)作用3，4。在此根底上，為了進一步討論apptin基因誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡機制，本文討論apptin基因在誘導(dǎo)腫瘤細胞A3

6、75凋亡時pspase-8和aspase-3的活性變化。1材料與方法11材料Lipfetina、凋亡細胞DNA提取試劑盒(美國Invitgen公司)；溴化丙啶(PI)和RT-PR試劑盒(美國Siga公司)；aspase-8檢測試劑盒(美國albihe-Nvabihe公司)和aspase-3底物A-DEVD-pNA(英國Alexls公司)；流式細胞儀(美國ulter公司)；550型酶標免疫測定儀(瑞典Bi-Rad公司)。其他化學試劑均為國產(chǎn)分析純。質(zhì)粒pDNAA3由本室構(gòu)建，內(nèi)含腫瘤特異性凋亡基因，采用鹼變性法大量提取質(zhì)粒DNA，用PEG沉淀法進展純化，所得質(zhì)粒DNA含量為2g/L，純度到達電泳

7、純5。人黑色素瘤細胞A375引自軍事醫(yī)學科學院。12方法121細胞瞬間轉(zhuǎn)染參照Lipfetain轉(zhuǎn)染說明書進展。轉(zhuǎn)染前24h，將A375細胞重鋪在T25培養(yǎng)瓶中，待細胞長至底面積80%時，進展轉(zhuǎn)染。將10lDNA和20lLipfetain各參加500l無血清(DE)中，輕輕震蕩5in，將二者混合即成轉(zhuǎn)染液。室溫靜置20in，用無血清DE洗細胞2次，參加5l無血清的DE，逐滴參加轉(zhuǎn)染液，邊加邊輕輕混合，置37孵育8h。棄去轉(zhuǎn)染液，換含100l/L新生牛血清的DE培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)。分別于轉(zhuǎn)染后的不同時間，觀察并取轉(zhuǎn)染細胞進展鑒定，用等量的pDNA31空質(zhì)粒作轉(zhuǎn)染對照。122RT-PR鑒定取1106

8、個轉(zhuǎn)染不同時間的A375細胞，按異硫氰酸胍一步法，提取總RNA，作為RT-PR的模板，用RT-PR擴增ApptinDNA6。123凋亡細胞DNA鑒定DNA凝膠電泳，取1106個A375細胞，參加500l細胞裂解液(10l/LTris-HLpH74、10l/L乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)、150l/LNal、5g/L十二烷基硫酸鈉(SDS)及400g/L蛋白酶K)，于50作用3h，不時振遙參加等體積的平衡酚、氯仿-異戊醇抽提后，以2500r/in離心10in，加25倍無水乙醇沉淀。用700l/L乙醇沉淀、枯燥后，將DNA溶入40lTE液中，參加20l的10g/LRnase，37水浴30in。取3

9、0lDNA，進展15g/L瓊脂糖凝膠電泳，細胞發(fā)生凋亡時可出現(xiàn)梯形條帶。124apptin基因誘導(dǎo)A375細胞凋亡的流式細胞術(shù)檢測轉(zhuǎn)染后24，48和72h，搜集各組細胞于離心管中，用PBS洗2次，加-4預(yù)冷的乙醇振蕩、固定后，于4保存過夜；用PBS洗2次棄固定液；200lRNA酶(RNaseA)震散，于37水浴中30in后，加800l溴化丙啶(PI)染色液，混勻，于4避光30in。在活細胞狀態(tài)下，PI可與凋亡細胞結(jié)合，在熒光照射下發(fā)紅光。400目尼龍網(wǎng)過濾后，用Elite流式細胞儀檢測每份樣品中的10000個細胞，觀察激發(fā)波長488n處的紅色熒光。125aspase-8活性的檢測按試劑盒方法進

10、展。搜集各實驗組的細胞(2106)，加40l細胞裂解緩沖液，冰浴20in，反復(fù)凍融4次，待細胞完全破碎后，于4以15000r/in離心5in。搜集上清，與200l/L的底物(IETD)-pNA混勻，加于微量96孔板中，終體積為100l/孔，于25溫育6h后，用酶標儀測定波長405n的吸光度(A)值。結(jié)果以A405值(即底物中對硝基苯胺pNA的釋放量)表示aspase-8的活性。126aspase-3的活性測定分別搜集轉(zhuǎn)染后細胞，進展aspase-3的活性測定。各組細胞按文獻7處理后，參加aspase-3的底物A-DEVD-pNA，使其終濃度為50l/L，置37孵育1h后，轉(zhuǎn)移至96孔酶標板中，

11、用酶標免疫測定儀測定A405值，以此來表示aspase-3的相對活性，組間比擬采用方差分析。2結(jié)果21轉(zhuǎn)染細胞中ApptinRNA的表達以A375細胞轉(zhuǎn)染后24和48h的總RNA為模板，經(jīng)RT-PR均可擴增出apptinDNA，說明apptin已在轉(zhuǎn)染細胞中表達。正常A375細胞和空載體轉(zhuǎn)染細胞均為陰性(圖1)。1：DNA分子量DL200；2：轉(zhuǎn)染后24h；3：轉(zhuǎn)染后48h；4：非轉(zhuǎn)染A375對照圖1apptin瞬間轉(zhuǎn)染A375細胞不同時間RT-PR結(jié)果略22凋亡細胞DNA瓊脂糖電泳Apptin瞬間轉(zhuǎn)染的A375細胞有典型的細胞凋亡所具有的DNA梯狀條帶，說明有凋亡發(fā)生(圖2)。13：轉(zhuǎn)染后2

12、4，48，72h細胞DNA；4：非轉(zhuǎn)染A375對照圖2apptin瞬間轉(zhuǎn)染A375細胞不同時間凋亡細胞DNA電泳結(jié)果略23apptin基因誘導(dǎo)A375細胞凋亡的流式細胞術(shù)分析A375細胞以apptin基因轉(zhuǎn)染后48h，在DNA直方圖上的G1峰前，即出現(xiàn)1個明顯的亞2倍體峰(亞G1峰，即凋亡峰)，并隨著轉(zhuǎn)染時間延長而增強。細胞凋亡率與對照組比擬差異有統(tǒng)計學意義(P005)。24aspase-3和aspase-8相對活性的測定A375細胞經(jīng)pDNAA3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后24h實驗組aspase-3的活性開場升高，72h達頂峰，明顯高于正常細胞對照組和pDNA31對照組(P001)，而aspase-8的活性

13、沒有明顯變化(表1，表2)。表1不同時間aspase-3相對活性檢測略注：與pDNA312組比擬，aP005，bP001表2不同時間aspase-8相對活性檢測略3討論研究說明，腫瘤特異性凋亡蛋白(apptin)具有特異誘導(dǎo)人腫瘤細胞和異常轉(zhuǎn)化細胞發(fā)生凋亡的作用，而對正常細胞沒有毒副作用。在克隆apptin的真核表達載體的根底，研究apptin經(jīng)體外瞬間轉(zhuǎn)染人黑色素瘤細胞A375，觀察誘導(dǎo)凋亡的作用。結(jié)果顯示，在apptin基因轉(zhuǎn)染后48h，A375細胞出現(xiàn)明顯的細胞凋亡特征，而且凋亡細胞的數(shù)量與apptin的轉(zhuǎn)染時間有關(guān)，隨著時間延長，A375細胞的凋亡比率明顯增加。為了討論在apptin誘

14、導(dǎo)腫瘤細胞發(fā)生凋亡時，是否與aspase-3的激活有關(guān)。本研究結(jié)果說明，A375細胞經(jīng)apptin基因轉(zhuǎn)染后24haspase-3的活性開場升高，72h達頂峰，并伴有明顯的細胞凋亡出現(xiàn)，實驗組aspase-3的相對活性明顯高于正常細胞對照組和pDNA31對照組；而aspase-8的活性沒有明顯變化。這一結(jié)果說明，apptin基因誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡與aspase-3的激活有關(guān)，但apptin是不通過哪個途徑激活aspase-8來激活aspase-3的。由于aspase家族的一些成員可通過級聯(lián)反響相繼活化，最終誘導(dǎo)細胞凋亡。因此，apspase誘導(dǎo)A375細胞凋亡過程中，是否通過激活aspase-9

15、來活化aspase-3，值得進一步討論。參考文獻1Danen-vanrshtAAA,GribergenJ,FisherDF,etal.ThehikenaneiavirusderivedprtEinapptinrequiresativatinfaspasesfrindutinfapptsisinhuanturells.J.Virl,2000,74:7072-7079.2Danen-vanrshtAAA,FisherDF,GribergenJ,etal.ApptininduesapptsisinhuantransfredandalignantellsbutntinnralellsJ.PrNatlAadSiUSA,1997,94:5843-5847.3賁松彬，趙洪禮，聶晶，等.腫瘤特異性凋亡基因誘導(dǎo)人淋巴瘤細胞凋亡的機制J.細胞與分子免疫學雜志，2022，21(4)：527-529.4聶晶，崔旭紅，趙洪禮，等.腫瘤特異性凋亡基因黑色素瘤細胞凋亡誘導(dǎo)作用J.中國公共衛(wèi)生，2022，20(1)：54-51.5