蛋白質(zhì)質(zhì)譜分析研究進(jìn)展

1、卵白質(zhì)質(zhì)譜闡發(fā)研究希望摘要：隨著科學(xué)的不竭生長(zhǎng)，運(yùn)用質(zhì)譜法舉行卵白質(zhì)的闡發(fā)日益增多，本文扼要綜述了肽和卵白質(zhì)等生物大分子質(zhì)譜闡發(fā)的特點(diǎn)、要領(lǐng)及卵白質(zhì)質(zhì)譜闡發(fā)的原理、方法和應(yīng)用，并對(duì)其生長(zhǎng)遠(yuǎn)景作出預(yù)測(cè)。關(guān)鍵詞：卵白質(zhì)，質(zhì)譜闡發(fā)，應(yīng)用媒介：卵白質(zhì)是生物體中含量最高，成效最緊張的生物大分子，存在于全部生物細(xì)胞，約占細(xì)胞干質(zhì)量的50%以上，作為生命的物質(zhì)底子之一，卵白質(zhì)在催化生命體內(nèi)種種反響舉行、調(diào)治代謝、抵抗外來(lái)物質(zhì)入侵及操縱遺傳信息等方面都起著至關(guān)緊張的作用，因此卵白質(zhì)也是生命科學(xué)中極為緊張的研究東西。關(guān)于卵白質(zhì)的闡發(fā)研究，不停是化學(xué)家及生物學(xué)家極為存眷的題目，其研究的內(nèi)容重要包羅分子量測(cè)定，氨基

2、酸斷定，卵白質(zhì)序列闡發(fā)及立體化學(xué)闡發(fā)等。隨著生命科學(xué)的生長(zhǎng)，儀器闡發(fā)本領(lǐng)的更新，尤其是質(zhì)譜闡發(fā)技能的不竭成熟，使這一范疇的研究生長(zhǎng)敏捷。自約翰.芬恩(JhnB.Fenn)和田中耕一(Kihi.Tanaka)創(chuàng)造白對(duì)生物大分子舉行確認(rèn)和布局闡發(fā)的要領(lǐng)及創(chuàng)造白對(duì)生物大分子的質(zhì)譜闡發(fā)法以來(lái)，隨著生命科學(xué)及生物技能的敏捷生長(zhǎng)，生物質(zhì)譜如今已成為有機(jī)質(zhì)譜中最活潑、最富生命力的前沿研究范疇之一1。它的生長(zhǎng)強(qiáng)有力地鞭策了人類(lèi)基因組籌劃及厥后基因組籌劃的提早完成和有力實(shí)行。質(zhì)譜法已成為研究生物大分子特別是卵白質(zhì)研究的重要支持技能之一，在對(duì)卵白質(zhì)布局闡發(fā)的研究中占據(jù)了緊張職位2。1質(zhì)譜闡發(fā)的特點(diǎn)質(zhì)譜闡發(fā)用于卵白

3、質(zhì)等生物活性分子的研究具有如下長(zhǎng)處：很高的敏捷度能為亞微克級(jí)試樣提供信息，能最有用地與色譜聯(lián)用，實(shí)用于龐大體系中痕量物質(zhì)的斷定或布局測(cè)定，同時(shí)具有正確性、易操縱性、快速性及很好的普適性。2質(zhì)譜闡發(fā)的要領(lǐng)比年來(lái)涌現(xiàn)出較樂(lè)成地用于生物大分子質(zhì)譜闡發(fā)的軟電離技能重要有以下幾種：1)電噴霧電離質(zhì)譜；2)基質(zhì)幫助激光解吸電離質(zhì)譜；3)快原子轟擊質(zhì)譜；4)離子噴霧電離質(zhì)譜；5)大氣壓電離質(zhì)譜。在這些軟電離技能中，從前面三種比年來(lái)研究得最多，應(yīng)用得也最普及3。3卵白質(zhì)的質(zhì)譜闡發(fā)蛋自質(zhì)是一條或多條肽鏈以特別方法組合的生物大分子，龐大布局重要包羅以肽鏈為底子的肽鏈線(xiàn)型序列稱(chēng)為一級(jí)布局及由肽鏈卷曲折疊而形成三維稱(chēng)

4、為二級(jí)，三級(jí)或四級(jí)布局。如今質(zhì)譜重要測(cè)定蛋自質(zhì)一級(jí)布局包羅分子量、肽鏈氨基酸排序及多肽或二硫鍵數(shù)量和位置。3.1卵白質(zhì)的質(zhì)譜闡發(fā)原理以往質(zhì)譜()僅用于小分子揮發(fā)物質(zhì)的闡發(fā)，由于新的離子化技能的出現(xiàn)，如介質(zhì)幫助的激光剖析/離子化、電噴霧離子化，種種新的質(zhì)譜技能開(kāi)始用于生物大分子的闡發(fā)。其原理是：通過(guò)電離源將卵白質(zhì)分子轉(zhuǎn)化為氣相離子，然后使用質(zhì)譜闡發(fā)儀的電嘗磁場(chǎng)將具有特定質(zhì)量與電荷比值(/值)的卵白質(zhì)離子分散開(kāi)來(lái)，顛末離子檢測(cè)器網(wǎng)絡(luò)分散的離子，確定離子的/值，闡發(fā)斷定未知卵白質(zhì)。3.2卵白質(zhì)和肽的序列闡發(fā)當(dāng)代研究效果創(chuàng)造越來(lái)越多的小肽同卵白質(zhì)一樣具有生物成效，創(chuàng)立具有特別、高效的生物成效肽的肽庫(kù)是

5、如今的研究熱門(mén)之一。因此必要高服從、高敏捷度的肽和卵白質(zhì)序列測(cè)定要領(lǐng)支持這些研究的舉行?，F(xiàn)有的肽和卵白質(zhì)測(cè)序要領(lǐng)包羅末了序列測(cè)定的化學(xué)要領(lǐng)Edan法、末了酶解要領(lǐng)、末了化學(xué)落解法等，這些要領(lǐng)都存在一些缺陷。比方作為肽和卵白質(zhì)序列測(cè)定尺度要領(lǐng)的末了氨基酸苯異硫氰酸酯(phenylisthiyanate)PIT闡發(fā)法(即Edan法，又稱(chēng)PTH法)，測(cè)序速率較慢(50個(gè)氨基酸殘基/天)；樣品用量較大(nl級(jí)或幾十pl級(jí))；對(duì)樣品純度要求很高；對(duì)付修飾氨基酸殘基每每會(huì)錯(cuò)誤識(shí)別，而對(duì)末了庇護(hù)的肽鏈那么無(wú)法測(cè)序4。末了化學(xué)落解測(cè)序規(guī)那么由于無(wú)法尋到PIT如許抱負(fù)的化學(xué)探針，其生長(zhǎng)仍面對(duì)著很大的困難。在這種

6、配景下，質(zhì)譜由于很高的敏捷度、正確性、易操縱性、快速性及很好的普適性而倍受科學(xué)家的普及留意。在質(zhì)譜測(cè)序中，敏捷度及正確性隨分子量增大有顯著低落，以是肽的序列闡發(fā)比卵白輕易很多，很多研究也都是以肽作為闡發(fā)東西舉行的。比年來(lái)隨著電噴霧電離質(zhì)譜(eletrsprayinisatin，ESI)及基質(zhì)幫助激光解吸質(zhì)譜(atrixassistedlaserdesrptin/inizatin，ALDI)等質(zhì)譜軟電離技能的生長(zhǎng)與美滿(mǎn)，極性肽分子的闡發(fā)成為大概，檢測(cè)限落落到fl級(jí)別，可測(cè)定分子量范疇那么高達(dá)100000Da，如今基質(zhì)幫助的激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜法(ALDITFS)已成為測(cè)定生物大分子尤其是卵白

7、質(zhì)、多肽分子量和一級(jí)布局的有用東西，也是當(dāng)此生命科學(xué)范疇中龐大課題卵白質(zhì)組研究所必不成缺的關(guān)鍵技能之一5。如今在歐洲分子生物實(shí)行室(EBL)及美國(guó)、瑞士等國(guó)的一些高校已創(chuàng)立了ALDITFS卵白質(zhì)一級(jí)布局(序列)譜庫(kù)，能為剖析FAST譜圖提供極大的幫助，并為確證闡發(fā)效果提供可靠的根據(jù)6。3.3卵白質(zhì)的質(zhì)譜闡發(fā)方法質(zhì)譜用于肽和卵白質(zhì)的序列測(cè)定重要可以分為三種要領(lǐng)：一種要領(lǐng)叫卵白圖譜(prtEinapping)，即用特異性的酶解或化學(xué)水解的要領(lǐng)將卵白切成小的片斷，然后用質(zhì)譜檢測(cè)各產(chǎn)物肽分子量，將所得到的肽譜數(shù)據(jù)輸入數(shù)據(jù)庫(kù)，搜刮與之相對(duì)應(yīng)的卵白，從而獵取待測(cè)卵白序列。將卵白質(zhì)繪制“肽圖是一緊張測(cè)列要領(lǐng)

8、。第二種要領(lǐng)是使用待測(cè)分子在電離及飛行歷程中產(chǎn)生的亞穩(wěn)離子，通過(guò)闡發(fā)相鄰?fù)M范例峰的質(zhì)量差，識(shí)別相應(yīng)的氨基酸殘基，此中亞穩(wěn)離子碎裂包羅“自身碎裂及外界作用誘導(dǎo)碎裂.第三種要領(lǐng)與Edan法有相似之處，即用化學(xué)探針或酶解使卵白或肽從端或端逐一落解下氨基酸殘基，形成彼此間差一個(gè)氨基酸殘基的系列肽，名為梯狀測(cè)序(laddersequening)，經(jīng)質(zhì)譜檢測(cè)，由相鄰峰的質(zhì)量差知道相應(yīng)氨基酸殘基。卵白的基團(tuán)越大，質(zhì)譜檢測(cè)的正確率越低。因此，在質(zhì)譜檢測(cè)之前，須將卵白消化成小分子的多肽，以進(jìn)步質(zhì)譜檢測(cè)的正確率。一樣平常而言，6-20個(gè)氨基酸的多肽最得當(dāng)質(zhì)譜儀的檢測(cè)。現(xiàn)今最常用的酶為胰卵白酶(trypsin)，

9、它于卵白的賴(lài)氨酸(lysine)和精氨酸(arginine)處將其堵截。因此，同一卵白經(jīng)胰卵白酶消化后，會(huì)產(chǎn)生雷同的多肽。簡(jiǎn)而言之，基質(zhì)幫助激光解吸電離/飛行時(shí)間質(zhì)譜丈量?jī)x是將多肽身分轉(zhuǎn)換成離子信號(hào)，并根據(jù)質(zhì)量/電荷之比(ass/harge，/z)來(lái)對(duì)該多肽舉行闡發(fā)，以斷定該多肽源自哪一個(gè)卵白。待檢樣品與含有在特定波長(zhǎng)下吸光的發(fā)光團(tuán)的化學(xué)基質(zhì)(atrix)混淆，此樣品混淆物隨即滴于一平板或載玻片上舉行揮發(fā)，樣品混淆物剩余水份和溶劑的揮發(fā)使樣品整合于格狀晶體中，樣品然后置于激光離子產(chǎn)生器(lasersure)。激光作用于樣品混淆物，使化學(xué)基質(zhì)汲取光子而被激活。此激活產(chǎn)生的能量作用于多肽，使之由固

10、態(tài)樣品混淆物釀成氣態(tài)。由于多肽分子傾向于汲取單一光子，故多肽離子帶單一電荷.這些形成的多肽離子直接進(jìn)入飛行時(shí)間質(zhì)量闡發(fā)儀(TFassanalyzer)。飛行時(shí)間質(zhì)量闡發(fā)儀用于丈量多肽離子由闡發(fā)儀的一端飛抵另一端探測(cè)器所必要的時(shí)間。而此飛行時(shí)間同多肽離子的質(zhì)量/電荷的比值成反比，即質(zhì)量/電荷之比越高，飛行時(shí)間越短。末了，由電腦軟件將探測(cè)器錄得的多肽質(zhì)量/電荷比值同數(shù)據(jù)庫(kù)中差異卵白經(jīng)卵白酶消化后所形成的特定多肽的質(zhì)量/電荷比值舉行比力，以斷定該多肽源自何種卵白.此法稱(chēng)為多肽質(zhì)量指紋闡發(fā)(peptideassfin-gerprinting)。基質(zhì)幫助激光解吸電離/飛行時(shí)間質(zhì)譜丈量法操縱輕便，敏感度高

11、，同很多卵白分散要領(lǐng)相匹配，并且，現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫(kù)中有富足的關(guān)于多肽質(zhì)量/電荷比值的數(shù)據(jù)，因此成為很多實(shí)行室的首選卵白質(zhì)譜斷定要領(lǐng)。同基質(zhì)幫助激光解吸電離/飛行時(shí)間質(zhì)譜丈量法在固態(tài)下完成差異，電子噴霧電離質(zhì)譜丈量法是在液態(tài)下完成，并且多肽離子帶有多個(gè)電荷，由高效液相層析等要領(lǐng)分散的液體多肽混淆物，在高壓下顛末一細(xì)針孔。當(dāng)樣本由針孔射出時(shí)，噴射成霧狀的微小液滴，這些微小液滴包羅多肽離子及水份等其他雜質(zhì)身分。去除這些雜質(zhì)身分后，多肽離子進(jìn)入一連質(zhì)量闡發(fā)儀(tan-deassanalyzer)，一連質(zhì)量闡發(fā)儀拔取某一特定質(zhì)量/電荷比值的多肽離子，并以碰撞解離的方法將多肽離子碎裂成差異電離或非電離片斷。隨后

12、，依質(zhì)量/電荷比值對(duì)電離片斷舉行闡發(fā)并搜集成離子譜(inspetru)，通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，由這些離子譜得到該多肽的氨基酸序列。根據(jù)氨基酸序列舉行的卵白斷定較根據(jù)多肽質(zhì)量指紋舉行的卵白斷定更正確、可靠。并且，氨基酸序列信息即可通過(guò)卵白氨基酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，也可通過(guò)核糖核酸數(shù)據(jù)庫(kù)檢索來(lái)舉行卵白斷定。4卵白質(zhì)質(zhì)譜闡發(fā)的應(yīng)用1981年起首接納FAB雙聚焦質(zhì)譜測(cè)定肽分子量，闡發(fā)十一肽(=1318)，質(zhì)譜中出現(xiàn)準(zhǔn)分子離子+1+=1319強(qiáng)峰。分子量小于6kDa肽或小卵白質(zhì)符合用FAB質(zhì)譜闡發(fā)，更大分子量的多肽和蛋自質(zhì)可用ALDI質(zhì)譜或ESI質(zhì)譜闡發(fā)。用ALDI-TF質(zhì)譜闡發(fā)蛋自質(zhì)最早一例是HillenKra

13、p等9于1988年提出用紫外激光以煙酸為基質(zhì)在譜儀上測(cè)出質(zhì)量數(shù)高達(dá)60kDa卵白質(zhì)，正確度開(kāi)始只有0.5%，后革新到0.1-0.2%。質(zhì)譜技能重要用于檢測(cè)雙向凝膠電泳或“雙向高效柱層析分散所得的卵白質(zhì)及酶解所得的多肽的質(zhì)量，也可用于卵白質(zhì)高級(jí)布局及卵白質(zhì)間彼此作用等方面的研究10,11,三條肽段的正確質(zhì)量數(shù)便可斷定卵白質(zhì)。比年來(lái)，串聯(lián)質(zhì)譜闡發(fā)儀生長(zhǎng)迅猛，其數(shù)據(jù)網(wǎng)羅方面的主動(dòng)化程度、檢測(cè)的敏感性及服從都大大進(jìn)步，大范圍數(shù)據(jù)庫(kù)和一些闡發(fā)軟件(如:SEQUEST)的應(yīng)用使得串聯(lián)質(zhì)譜闡發(fā)儀可以舉行更大范圍的測(cè)序事情。如今，使用2D電泳及技能對(duì)整個(gè)酵母細(xì)胞裂解產(chǎn)物舉行闡發(fā)，已經(jīng)斷定出1484種卵白質(zhì)，包

14、羅完備的膜卵白和低品貌的卵白質(zhì)12；闡發(fā)肝細(xì)胞癌患者血清卵白質(zhì)組身分13，并使用質(zhì)譜舉行斷定磷酸化卵白研究事情14及接納質(zhì)譜技能研究許旺細(xì)胞源神謀劃養(yǎng)卵白(SDNP)的分子布局15等?？⑹抡Z(yǔ)：在卵白質(zhì)的質(zhì)譜闡發(fā)中，質(zhì)譜的正確性(auray)對(duì)測(cè)定效果有很大影響，因此質(zhì)譜測(cè)序如今仍很難被應(yīng)用于未知卵白的序列測(cè)定。肽和卵白的質(zhì)譜序列測(cè)定要領(lǐng)具有快速、用量少、易操縱等長(zhǎng)處，這些都非常得當(dāng)于如今科學(xué)研究的必要。我們信賴(lài)，隨著種種衍生化要領(lǐng)和酶解要領(lǐng)的不竭革新，卵白雙向電泳的應(yīng)用16以及質(zhì)譜技能的不竭美滿(mǎn)，質(zhì)譜將會(huì)成為多肽和卵白質(zhì)闡發(fā)最有威力的東西之一。參考文獻(xiàn)8HarveyDJ.IdentifiatinfprtEin-bundarbhydratesbyassspetretryJ.Prtei,2001;1(2):311-328.9KARAS,HILLE