保肝寧對HSCT6細胞凋亡的影響

1、保肝寧對HSC-T6細胞凋亡的影響張緒富譚焱賀松其呂志平【摘要】目的不雅察復(fù)方保肝寧對HS-T6細胞凋亡的影響，以進一步探究保肝寧抗肝纖維化的作用機理。要領(lǐng)引進HS-T6細胞株并傳代造就。用復(fù)方保肝寧給正常大鼠灌胃，制備藥物血清，溫育造就細胞。用吖啶橙染色法和流式細胞儀測定細胞凋亡。結(jié)果正常大鼠血清造就組HS-T6細胞核DNA為黃色或黃綠色勻稱熒光，自身凋亡率為9.670.57%，復(fù)方保肝寧藥物血清一倍、兩倍劑量組細胞核或細胞質(zhì)內(nèi)可見致密濃染的黃綠色染色，甚或見黃綠色碎片，凋亡率別離為22.730.78%，23.972.50%，顯著高于正常比較組，差異有明顯性P0.01。結(jié)論體外造就的HS具有

2、必然程度的自身凋亡產(chǎn)生，復(fù)方保肝寧的促肝星狀細胞凋亡作用大概是其抗肝纖維化作用的重要機理之一?！娟P(guān)鍵詞】保肝寧肝纖維化肝星狀細胞細胞凋亡我們前期實行表白，保肝寧藥物血清能明顯按捺星狀細胞HS增殖并按捺型膠原含量的表達1。為了進一步相識該方的抗肝纖維化作用機理，我們接納體外造就HS的血清藥理學(xué)要領(lǐng)，運用吖啶橙染色法和流式細胞儀技能檢測星狀細胞凋亡，探究該方的大概作用機理。1質(zhì)料與儀器1.1HS-T6細胞株泉源HS-T6星狀細胞系來自美國加利福尼亞舊金山總病院肝病中央實行室Friedan傳授，由上海中醫(yī)藥大學(xué)肝病研究所奉送。1.2試劑碘化丙啶PI染液上海生工出品，Aridinerange(吖啶橙)

3、上海生工出品，HighGluseDE干粉為GibBRL產(chǎn)物，小牛血清購于杭州四序青生物工程研究所。1.3儀器熒光顯微鏡LYPUSBHT；流式細胞儀BETNFAS420；lypus光學(xué)顯微鏡，日本lypus公司。2造就箱，美國NAP5410水套式。電熱恒溫水浴箱，上海瀘南科學(xué)儀器聯(lián)營廠出品。96孔酶標(biāo)板、各式造就板為丹麥NUN公司產(chǎn)物。2要領(lǐng)2.1藥物、藥物血清的制備2.2HS-T6細胞清醒、凍存、造就與傳代設(shè)置DEHighgluse造就基1000l：DE1包、NaH32.5g、HEPES2.38g、鏈霉素0.1g、青霉素0.0625g、雙蒸水加至1000l。0.25%Trypsin-0.02%

4、EDTA胰酶100l：Trypsin0.25g、EDTA0.02g、D-Hanks100l。谷氨酰胺10l：Nal0.085g、谷氨酰胺292g、加H2至10l。10小牛血清DE造就HS-T6細胞。待細胞貼壁后換5%小牛血清的DEH造就基，以1%谷氨酰胺的比例添加至造就基，每2周加1次。細胞長滿單層后，胰酶消化，傳代造就。細胞凍存時以細胞懸液1l加DS100l、小牛血清900l，放至-80冰箱或液氮罐中凍存。細胞清醒時，將細胞敏捷復(fù)溫至37，無血清造就基洗1遍，離心，去上清，加10%小牛血清DEH造就。2.3吖啶橙染色法不雅察保肝寧對HS-T6凋亡的影響32.4流式細胞術(shù)闡發(fā)保肝寧對HS-T6

5、的凋亡影響3實行分組和細胞造就要領(lǐng)同上，每組設(shè)3標(biāo)本重復(fù)。詳細實行步調(diào)如下：設(shè)置PI染液：100g/l，Rnase100g/l，4避光保存。網(wǎng)絡(luò)細胞2106/l離心5001000r/in5in，去上清，3lPBS洗。在細胞團遲鈍參加804乙醇，結(jié)實124h。3lPBS重懸，400目鋼網(wǎng)過濾，5001000r/in，5in離心去上清。參加1lPI染液4作用30in。上機檢測：流式細胞儀檢測細胞內(nèi)DNA含量，由488n引發(fā)，用610n濾過鏡檢測。2.5統(tǒng)計學(xué)要領(lǐng)上述各項指標(biāo)均s表現(xiàn)，用統(tǒng)計軟件SPSS10.0舉行單因素變量方差闡發(fā)和SNK兩兩比力。3結(jié)果3.1熒光染色法不雅察復(fù)方保肝寧藥物血清對H

6、S-T6細胞凋亡的結(jié)果在熒光顯微鏡下，正常大鼠血清造就HS細胞核DNA為黃色或黃綠色勻稱熒光，細胞質(zhì)和核仁的RNA為橘黃色或橘赤色熒光見圖1。保肝寧藥物血清組可見散在細胞凋亡，細胞核或細胞質(zhì)內(nèi)可見致密濃染的黃綠色染色，甚或見黃綠色碎片見圖23。圖1正常組HS-T6細胞吖啶橙染色圖21倍劑量組HS-T6細胞吖啶橙染色3.2流式細胞術(shù)闡發(fā)保肝寧藥物血清對HS-T6凋亡的影響保肝寧藥物血清組的DNA直方圖均可見到顯著的亞二倍體峰sub-G1峰存在。1倍，2倍劑量藥物血清組的凋亡率別離為22.730.78見圖4，23.972.50%見圖5，顯著高于正常比較組9.670.57%見圖6，P0.01。1倍，

7、2倍劑量組間未見劑量依靠干系P0.05。4討論肝纖維化是種種慢性肝病希望為肝硬化的必經(jīng)途徑，其本色是肝內(nèi)E的合成與落解失去平衡，導(dǎo)致E尤其是膠原的過分沉積和漫衍非常。只管幾種肝臟細胞均能合成E，如今同等以為，激活的HS為肝纖維化時產(chǎn)生種種E身分的重要細胞群4，5。對HS的成效特點及其激活調(diào)控機制的研究已成為比年來肝纖維化產(chǎn)生氣制及抗肝纖維化藥物研究中的熱門之一。凋亡也稱為步伐性細胞殞命。已往的三十多年來，人們已漸漸熟悉到凋亡對生理和病理性細胞數(shù)量淘汰起主導(dǎo)調(diào)控作用。凋亡通過和增殖配合作用調(diào)控著構(gòu)造內(nèi)細胞總數(shù)?，F(xiàn)已有實行表白，靜息狀態(tài)的HS未見凋亡產(chǎn)生，但隨著HS的激活，出現(xiàn)D95(AP-1/F

8、as)、D95L(AP-1/Fas-ligand)的表達和細胞凋亡，在完全激活的HS中凋亡率達18%6。免疫組化染色表現(xiàn)隨HS的活化，HS出現(xiàn)自覺性凋亡，并且凋亡的產(chǎn)生隨激活歷程而漸漸增長，肝損傷規(guī)復(fù)期HS總數(shù)淘汰，HS凋亡比例亦隨之淘汰，表白活化HS重要通過凋亡閉幕其活化。活化的HS凋亡在實行性肝纖維化四氯化碳和膽管結(jié)扎模子自愈歷程中起到了關(guān)鍵作用7，8。相反，制止凋亡和延伸活化的HS保存可以或許促進肝纖維化歷程9。如今，通過促進HS凋亡淘汰其數(shù)量而抗肝纖維化的研究正在獲得希望。實行表白，真菌代謝物膠霉素在體表里均能誘導(dǎo)HS凋亡。賜與l4肝纖維化大鼠膠霉素治療可導(dǎo)致活化HS數(shù)量淘汰50%通過凋亡介導(dǎo)，HS凋亡的同時肝臟內(nèi)纖維化程度也明顯減輕10。中藥復(fù)方861合劑11、丹參單體IH764-312也可通過按捺HS增殖、促進其凋亡而到達抗肝纖維化結(jié)果。正是思量到HS增殖和凋亡在肝纖維化形成和修復(fù)中的緊張性，如今，按捺HS活化增殖和促進其凋亡作為肝纖維化的治療計謀已成為國表里學(xué)者的共鳴13。本實行研究表白，HS-T6細胞傳代造就48h后的自身凋亡率為9.670.57%，表白其自身可通