大腸菌群計(jì)數(shù)課件

1、大腸菌群計(jì)數(shù)大腸菌群計(jì)數(shù)大腸菌群的定義指一群在36條件下培養(yǎng)48h能發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸產(chǎn)氣的需氧和兼性厭氧革蘭氏陰性無芽胞桿菌。該菌群主要來源于人畜糞便, 作為糞便污染指標(biāo)評價(jià)食品的衛(wèi)生狀況, 推斷食品中腸道致病菌污染的可能。大腸菌群不是細(xì)菌學(xué)上分類命名，而是一組與糞便污染有關(guān)的細(xì)菌。這群細(xì)菌包括：大腸埃希氏菌、檸檬酸桿菌、產(chǎn)氣克雷伯氏菌和陰溝腸桿菌。生化特征及血清學(xué)反應(yīng)并非完全一致。大腸菌群的定義指一群在36條件下培養(yǎng)48h能發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸分布：廣泛分布于自然環(huán)境。來源于人和溫血動物的糞便。衛(wèi)生學(xué)意義大腸菌群作為糞便污染的指標(biāo)菌評價(jià)樣品中是否受到糞便的污染。大腸菌群計(jì)數(shù)的高低，直接反映了樣品受糞

2、便污染的程度。表示對人體健康是否具有潛在的危險(xiǎn)性。分布：大腸菌群是理想的糞便污染的指標(biāo)菌是人類和溫血動物腸道菌群，在數(shù)量上占優(yōu)勢。隨糞便排出體外后，在外界環(huán)境影響下，其存活時(shí)間應(yīng)與腸道致病菌大致相似或稍長。檢驗(yàn)方法簡便，易于檢出與計(jì)數(shù)。對消毒劑的抵抗力應(yīng)不低于腸道致病菌。大腸菌群是理想的糞便污染的指標(biāo)菌主要修改內(nèi)容將原標(biāo)準(zhǔn)拆分為大腸菌群、糞大腸菌群和大腸桿菌計(jì)數(shù)三個(gè)獨(dú)立的標(biāo)準(zhǔn)方法，標(biāo)準(zhǔn)名稱變化。大腸菌群的MPN法中乳糖膽鹽等培養(yǎng)基改為月桂基硫酸鹽胰蛋白眎(LST)肉湯為主的培養(yǎng)基；增加了對樣品勻液的pH范圍要求；增加了大腸菌群的平板計(jì)數(shù)法和紙片檢測法；MPN法的結(jié)果報(bào)告由原“每100g（mL）

3、大腸菌群的MPN值”，修改為“每1 g（mL）大腸菌群的MPN值”；主要修改內(nèi)容將原標(biāo)準(zhǔn)拆分為大腸菌群、糞大腸菌群和大腸桿菌計(jì)數(shù)大腸菌群計(jì)數(shù)第一法：MPN法第二法：平板計(jì)數(shù)法第三法：Petrifilm測試片法大腸菌群計(jì)數(shù)第一法：MPN法第一法 大腸菌群檢驗(yàn)MPN法第一法 大腸菌群檢驗(yàn)MPN法原標(biāo)準(zhǔn)乳糖膽鹽發(fā)酵管EMB瓊脂乳糖發(fā)酵管培養(yǎng)基改變情況新標(biāo)準(zhǔn)第一法：月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯（LST）煌綠乳糖膽鹽肉湯（BGLB）第二法：結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂(VRBA)煌綠乳糖膽鹽肉湯（BGLB）原標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基改變情況新標(biāo)準(zhǔn)操作步驟的改變原標(biāo)準(zhǔn)初發(fā)酵EMB分離培養(yǎng)染色，復(fù)發(fā)酵報(bào) 告現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)LST初發(fā)酵BGLB

4、驗(yàn)證報(bào) 告操作步驟的改變原標(biāo)準(zhǔn)初發(fā)酵EMB分離培養(yǎng)染色，復(fù)發(fā)酵報(bào) 告現(xiàn) 大腸菌群檢驗(yàn)程圖(新國標(biāo)MPN法)檢樣稀釋月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯（LST）36，24482h 不產(chǎn)氣產(chǎn)氣煌綠乳糖膽鹽肉湯（BGLB） 36，24482h 不產(chǎn)氣產(chǎn)氣大腸菌群陰性大腸菌群陽性報(bào)告 大腸菌群檢驗(yàn)程圖(新國標(biāo)MPN法)檢樣稀釋月桂基硫酸樣品的處理和稀釋固體和半固體食品：以無菌操作取25g）樣品,放入裝有225 mL生理鹽水的無菌均質(zhì)杯內(nèi),于8000 r/min均質(zhì)1min2min,制成1:10樣品勻液，或放入225 mL生理鹽水的無菌均質(zhì)袋中，用均質(zhì)器拍打1min2min，制成1:10的樣品勻液。液體食品：以無

5、菌吸管吸取樣品25mL放入裝有225mL生理鹽水的無菌玻璃瓶(瓶內(nèi)預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的玻璃珠)中,以30cm幅度、于7s內(nèi)振搖25次(或以機(jī)械振蕩器振搖),制成1:10的樣品勻液。樣品的處理和稀釋固體和半固體食品：以無菌操作取25g）樣品,根據(jù)對樣品污染情況的估計(jì),按上述操作，依次制成系列十倍系列樣品勻液。每遞增稀釋1次，換用1支1mL無菌吸管。從制備樣品勻液至樣品接種完畢，全過程不得超過15min。 樣品勻液的pH值應(yīng)在6.57.5之間，必要時(shí)要進(jìn)行調(diào)節(jié)，如有些果汁pH值很低，如果不進(jìn)行調(diào)節(jié)，檢驗(yàn)結(jié)果的誤差可能就會比較大。根據(jù)對樣品污染情況的估計(jì),按上述操作，依次制成系列十倍系列樣選擇適宜的三個(gè)連

6、續(xù)稀釋度的樣品勻液，液體樣品可以包括未經(jīng)稀釋的原液，每個(gè)稀釋度接種三管月桂基硫酸鹽胰蛋白胨（LST）肉湯，每管接種1mL（如接種量需要超過1mL，則用雙料LST肉湯）。361培養(yǎng)24h2h，檢查倒管內(nèi)是否有氣泡產(chǎn)生或輕搖試管時(shí)是否有密集連續(xù)的細(xì)小氣泡從管底逸出，如未產(chǎn)氣則繼續(xù)培養(yǎng)至48h2h。第一步：初發(fā)酵選擇適宜的三個(gè)連續(xù)稀釋度的樣品勻液，液體樣品可以包括未經(jīng)稀釋記錄在24h和48h內(nèi)產(chǎn)氣的LST肉湯管數(shù)。未產(chǎn)氣者為大腸菌群陰性；對產(chǎn)氣者，則進(jìn)行復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)。注意：以48h2h為最終觀察結(jié)果時(shí)限。結(jié)果也以此時(shí)為最終結(jié)果。記錄在24h和48h內(nèi)產(chǎn)氣的LST肉湯管數(shù)。未產(chǎn)氣者為大腸菌用接種環(huán)從所有

7、48h2h內(nèi)發(fā)酵產(chǎn)氣的LST肉湯管中分別取培養(yǎng)物1環(huán)，移種于煌綠乳糖膽鹽(BGLB)肉湯管中，置361溫箱內(nèi)，培養(yǎng)48h2h，觀察產(chǎn)氣情況。產(chǎn)氣者，計(jì)為大腸菌群陽性管。第二步：復(fù)發(fā)酵用接種環(huán)從所有48h2h內(nèi)發(fā)酵產(chǎn)氣的LST肉湯管中分別取培月桂基磺酸鈉能抑制革蘭氏陽性菌的生長，同時(shí)比膽鹽的選擇性和穩(wěn)定性好。由于膽鹽與酸產(chǎn)生沉淀，沉淀有時(shí)候會使對產(chǎn)氣情況的觀察變得有些困難； 乳糖是大腸菌群可利用發(fā)酵的糖類。有利于大腸菌群的生長繁殖并有助于鑒別大腸菌群和腸道致病菌；胰蛋白胨提供基本的營養(yǎng)成分；LST肉湯是國際上通用的培養(yǎng)基，與乳糖膽鹽肉湯的作用和意義相同，但具有更多的優(yōu)越性。月桂基磺酸鹽胰蛋白胨（

8、LST）月桂基磺酸鈉能抑制革蘭氏陽性菌的生長，同時(shí)比膽鹽的選擇性和穩(wěn)發(fā)酵試驗(yàn)判定原則：產(chǎn)氣為陽性。檢測步驟減少（不必分離培養(yǎng)），檢測時(shí)間縮短24h。注：如接種量超過1mL，則應(yīng)用雙料LST肉湯發(fā)酵試驗(yàn)判定原則：產(chǎn)氣為陽性。膽鹽可抑制革蘭氏陽性菌?；途G是抑菌抗腐劑，可增強(qiáng)對革蘭氏陽性菌的抑制作用。乳糖是大腸菌群可利用發(fā)酵的糖類。有利于大腸菌群的生長繁殖并有助于鑒別大腸菌群和腸道致病菌。發(fā)酵試驗(yàn)判定原則：產(chǎn)氣為陽性。由于配方里有膽鹽，膽鹽遇到大腸菌群分解乳糖所產(chǎn)生的酸形成膽酸沉淀，培養(yǎng)基可由原來的綠色變?yōu)辄S色，同時(shí)可看到管底通常有沉淀。煌綠乳糖膽鹽肉湯（BGLB）膽鹽可抑制革蘭氏陽性菌?；途G乳糖膽

9、鹽肉湯（BGLB）結(jié)果報(bào)告根據(jù)大腸菌群陽性管數(shù), 查MPN檢索表，報(bào)告每 g (mL)樣品中大腸菌群的MPN值。結(jié)果報(bào)告根據(jù)大腸菌群陽性管數(shù), 查MPN檢索表，報(bào)告每 g MPN檢索表的應(yīng)用MPN（最可能數(shù)）是表示樣品中活菌密度的估測。因此MPN值只是活菌密度的估算值，并不是樣品中活菌數(shù)的真值。MPN檢索表的應(yīng)用MPN（最可能數(shù)）是表示樣品中活菌密度的估1g(mL)檢樣中最大可能數(shù)（MPN）表-4201100333948.7272124,1001801100233424.5201122,00090460133423.7150121,00042240033424.5202021,00090290

10、323423.61410243040210223381.49.200242037150123424.5160314201893023424.51512142040160313423.61102142037120213383.6111112001775113201.37.4011180943013383.6112011801764203181.37.21011108.738103180.173.6001944.623003383.69.4030948.736132181.26.2020948.729032181.26.1110948.735222110.153.0010948.7281229.6

11、0.153.0100424.5210229.5-1100使用MPN檢索表的注意點(diǎn)這個(gè)MPN檢索表是ISO、FDA、AOAC、USDA/FSIS、北歐等標(biāo)準(zhǔn)通用的。表里的數(shù)字是有小數(shù)點(diǎn)的。報(bào)告單位不同?，F(xiàn)報(bào)告單位為g/ml，而原報(bào)告單位是100g/ml。原標(biāo)準(zhǔn)MPN表有64個(gè)組合，而現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)MPN表只有40個(gè)組合。使用MPN檢索表的注意點(diǎn)這個(gè)MPN檢索表是ISO、FDA、A當(dāng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果在MPN表中無法查找到MPN值時(shí)，如：陽性管數(shù)為122，123，232，233等時(shí)，建議增加稀釋度(可做45個(gè)稀釋度)，使樣品的最高稀釋度能達(dá)到獲得陰性終點(diǎn)，然后再遵循相關(guān)的規(guī)則進(jìn)行查找，最終確定MPN值。當(dāng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果在

12、MPN表中無法查找到MPN值時(shí)，如：陽性管數(shù)為1第二法 平板計(jì)數(shù)法第二法 平板計(jì)數(shù)法適用范圍與培養(yǎng)基平板計(jì)數(shù)法相對于MPN法來說，檢驗(yàn)結(jié)果更精確。適合用于污染比較嚴(yán)重的樣品，但對于污染菌量太少的樣品，還是MPN法更有優(yōu)勢。所用培養(yǎng)基：VRBA瓊脂、BGLB培養(yǎng)基。適用范圍與培養(yǎng)基平板計(jì)數(shù)法相對于MPN法來說，檢驗(yàn)結(jié)果更精確平板計(jì)數(shù)法的檢驗(yàn)程序檢樣25g(ml)+225ml稀釋液，均質(zhì)10倍系列稀釋選擇23個(gè)適宜稀釋度的樣液，接種VRBA平板計(jì)數(shù)典型和可疑菌落3611824hBGLB肉湯證實(shí)試驗(yàn)3611824h報(bào)告結(jié)果注：VRBA(結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂)又稱為：VRB或VRBL平板計(jì)數(shù)法的檢驗(yàn)程

13、序檢樣25g(ml)+225ml稀釋液，均操作要點(diǎn)樣品稀釋同第一法。選取適宜的23個(gè)連續(xù)稀釋度, 每個(gè)稀釋度接種兩個(gè)滅菌平皿, 每皿1mL。另取1mL生理鹽水做個(gè)空白對照。將冷至46的結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂(VRBA)約15mL傾注于每個(gè)平皿中。小心旋轉(zhuǎn)平皿，將培養(yǎng)基與樣液充分混勻，待瓊脂凝固后，再加3 mL4 mLVRBA覆蓋平板表層。操作要點(diǎn)樣品稀釋同第一法。平板菌落數(shù)的選擇選擇菌落數(shù)在30150之間的平板，分別計(jì)數(shù)平板上出現(xiàn)的典型和可疑大腸菌群菌落。典型菌落為紫紅色，菌落周圍有膽鹽與酸形成的沉淀環(huán)，菌落直徑為0.5mm或更大。平板菌落數(shù)的選擇選擇菌落數(shù)在30150之間的平板，分別計(jì)數(shù)從VR

14、BA平板上挑取10個(gè)不同類型的典型和可疑菌落，分別移種于BGLB肉湯管內(nèi)，進(jìn)行證實(shí)試驗(yàn)。BGLB肉湯管產(chǎn)氣者，所對應(yīng)的菌落即為大腸菌群陽性菌落。證實(shí)試驗(yàn)從VRBA平板上挑取10個(gè)不同類型的典型和可疑菌落，分別移種結(jié)果報(bào)告經(jīng)最后證實(shí)為大腸菌群陽性的BGLB管的百分比乘以計(jì)數(shù)的平板菌落數(shù)，再乘以稀釋倍數(shù)，即為每g (mL)樣品中大腸菌群數(shù) 。例：10-4樣品稀釋液1ml在VRBA平板上有100個(gè)典型和可疑菌落，挑取10個(gè)接種BGLB肉湯，證實(shí)6個(gè)為陽性。則樣品大腸菌群數(shù)為：1006/1010-4/g(mL)=6.0105cfu/g(mL)結(jié)果報(bào)告經(jīng)最后證實(shí)為大腸菌群陽性的BGLB管的百分比乘以計(jì)數(shù)

15、什么樣的菌落必須要做證實(shí)試驗(yàn)?一是非典型菌落，如在顏色、直徑與典型菌落不符合的菌落。另一種情況是被檢樣品中含有乳糖以外的其他糖類，如牛奶、飲料等樣品。本來大腸菌群的定義是發(fā)酵乳糖，但由于樣品含有的其他糖類混入了培養(yǎng)基，使得不能分解乳糖但能分解其他糖類的細(xì)菌也能夠長出紅色菌落，所以需要進(jìn)行證實(shí)實(shí)驗(yàn)。什么樣的菌落必須要做證實(shí)試驗(yàn)?一是非典型菌落，如在顏色、直徑結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂(VRBA)VRBA的主要成分：乳糖、膽鹽、結(jié)晶紫、中性紅及細(xì)菌生長所必需的營養(yǎng)成分如:蛋白胨、酵母膏等。結(jié)晶紫和中性紅為VRBA的指示劑系統(tǒng)，在酸性條件下為紫紅色。大腸菌群分解乳糖所產(chǎn)生的酸與膽鹽結(jié)合，可形成沉淀。結(jié)晶紫

16、中性紅膽鹽瓊脂(VRBA)VRBA的主要成分：乳糖、膽第三法 大腸菌群PetrifilmTM測試片法第三法 大腸菌群PetrifilmTM測試片法大腸菌群PetrifilmTM測試片法原理PetrifilmTM大腸菌群測試片是一種預(yù)先制備好的培養(yǎng)基系統(tǒng)，含有VRB 培養(yǎng)基，冷水可溶性凝膠和TTC指示劑，可增強(qiáng)菌落計(jì)數(shù)效果。表面覆蓋的膠膜，可截留發(fā)酵乳糖的大腸菌群產(chǎn)生的氣體。培養(yǎng)結(jié)束后計(jì)數(shù)紅點(diǎn)周圍有氣泡的菌落為大腸菌群數(shù)。 大腸菌群PetrifilmTM測試片法原理Petrifil大腸菌群PetrifilmTM測試片檢驗(yàn)程序檢樣25g(ml)+225ml稀釋液，均質(zhì)10倍系列稀釋選擇23個(gè)適宜稀

17、釋度的樣液，接種PetrifilmTM大腸菌群測試紙片計(jì)數(shù)紅色帶氣泡菌落報(bào)告結(jié)果361242h大腸菌群PetrifilmTM測試片檢驗(yàn)程序檢樣25g(m操作要點(diǎn)按第一法的樣品制備方法進(jìn)行。樣品勻液的pH值應(yīng)在6.57.5之間，pH值過低或過高時(shí)分別用1M NaOH或1M HCl予以調(diào)節(jié)。合理稀釋度的選擇，每稀釋度接種2張測試片。接種時(shí)避免氣泡產(chǎn)生。培養(yǎng)基未凝固時(shí)勿挪動。將測試片的透明面朝上置于培養(yǎng)箱內(nèi)，堆疊片數(shù)不超過20片。操作要點(diǎn)按第一法的樣品制備方法進(jìn)行。避免人為產(chǎn)生的氣泡測試片上層膜緩慢落下；吸取樣品時(shí)避免泡沫吸入；測試片未凝固時(shí)勿挪動；如果產(chǎn)生人為氣泡，要作好標(biāo)記，這樣才能在判讀時(shí)和菌

18、落產(chǎn)生氣泡區(qū)分開。另外人為氣泡一般為不規(guī)則狀。避免人為產(chǎn)生的氣泡測試片上層膜緩慢落下；結(jié)果判讀大腸菌群為紅點(diǎn)帶氣泡的菌落；圓形邊緣上及邊緣外的菌落不計(jì)數(shù)；注意菌落濃度高的幾種情況。結(jié)果判讀大腸菌群為紅點(diǎn)帶氣泡的菌落；結(jié)果報(bào)告選取菌落數(shù)在15150之間的測試片作為計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)。選擇菌落數(shù)在15150之間的稀釋度，平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告之。如果所有稀釋度測試片上的菌落數(shù)都小于15, 則計(jì)數(shù)稀釋度最低的測試片上的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告之。如果所有稀釋度的測試片上均無菌落生長，則以()1乘以最低稀釋倍數(shù)報(bào)告之。如果最高稀釋度的菌落數(shù)大于150個(gè)時(shí)，計(jì)數(shù)最高稀釋度的測試片上的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告之。計(jì)數(shù)菌落數(shù)大于150個(gè)的測試片時(shí)，可計(jì)數(shù)一個(gè)或兩個(gè)具有代表性的方格內(nèi)的菌落數(shù)，換算成單個(gè)方格內(nèi)的菌落數(shù)后乘以20即為