金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)與計(jì)數(shù)課件

1、金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)與計(jì)數(shù)金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)與計(jì)數(shù)概況葡萄球菌屬微球菌科，本菌有個(gè)菌種，從人體上可檢出個(gè)種。葡萄球菌屬主要與皮膚腺體和溫血?jiǎng)游锏恼衬は嚓P(guān)系，有些種是人及動(dòng)物的條件致病菌。金黃色葡萄球菌對(duì)人類有致病性，通常被稱為病原性球菌。金黃色葡萄球菌可引起化膿性炎癥，又稱為化膿性球菌。概況葡萄球菌屬微球菌科，本菌有個(gè)菌種，從人體上可檢出個(gè)種。金黃色葡萄球菌的生物學(xué)特性形態(tài)與染色：金黃色葡萄球菌的典型形態(tài)呈球形，直徑，大小不一，平均直徑約為。革蘭氏染色陽(yáng)性，呈葡萄串狀排列。無(wú)鞭毛、無(wú)芽胞。在陳舊培養(yǎng)物中，衰老的菌體常轉(zhuǎn)為革蘭氏陰性。金黃色葡萄球菌的生物學(xué)特性形態(tài)與染色：培養(yǎng)特性：易培養(yǎng)，對(duì)營(yíng)養(yǎng)要

2、求不高，在普通培養(yǎng)基中生長(zhǎng)良好。需氧或兼性厭氧。最適生長(zhǎng)溫度，最適生長(zhǎng) 。耐鹽性強(qiáng)，在含的氯化鈉培養(yǎng)基中仍能生長(zhǎng)，可用于篩選菌種。在普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上培養(yǎng)，可形成圓形、表面光滑、不透明的菌落。可產(chǎn)生金黃色色素，色素為脂溶性，不溶于水，故色素只局限于菌落內(nèi)，不滲至培養(yǎng)中。培養(yǎng)特性：在血平板上可形成明顯透明的溶血環(huán)。為型溶血?？僧a(chǎn)生卵磷脂，在卵黃高鹽培養(yǎng)基上形成周圍有白色沉淀環(huán)的菌落。大多數(shù)菌株分解葡萄糖、麥芽糖、蔗糖，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣。甲基紅試驗(yàn)、 試驗(yàn)多為陽(yáng)性，不產(chǎn)生靛基質(zhì)。觸酶陽(yáng)性。在血平板上可形成明顯透明的溶血環(huán)。為型溶血。金黃色葡萄球菌的酶金黃色葡萄球菌可產(chǎn)生血漿凝固酶和耐熱酶。這兩種酶均與金

3、黃色葡萄球菌的致病性有關(guān)。血漿凝固酶：與金黃色葡萄球菌的致病力密切相關(guān)。一般認(rèn)為，血漿凝固陽(yáng)性的金黃色葡萄球菌菌株有致病力。否則為無(wú)致病力的菌株。血漿凝固酶對(duì)熱穩(wěn)定，能抵抗甚至后，仍能保存大部分活性。耐熱酶作為除血漿凝固酶外鑒定金黃色葡萄球菌致病力的指標(biāo)之一。該酶的最適為。金黃色葡萄球菌的酶金黃色葡萄球菌可產(chǎn)生血漿凝固酶和耐熱酶。這金黃色葡萄球菌腸毒素：是金黃色葡萄球菌一種重要的致病物質(zhì)。本菌引起的食物中毒是因?yàn)槭称肺廴玖私瘘S葡萄球菌后，由細(xì)菌產(chǎn)生大量腸毒素而導(dǎo)致的。近年報(bào)導(dǎo)表明，以上的金黃色葡萄球菌菌株在實(shí)驗(yàn)室條件下可產(chǎn)生腸毒素，并且個(gè)菌株能產(chǎn)生兩種或兩種以上的腸毒素。腸毒素是一種可溶性蛋白

4、質(zhì)，由單個(gè)無(wú)分枝的肽鏈組成。分子量約為左右。易溶于水，難溶于有機(jī)溶劑。金黃色葡萄球菌的腸毒素金黃色葡萄球菌腸毒素：是金黃色葡萄球菌一種重要的致病物質(zhì)。本耐熱，經(jīng)煮沸不被破壞，也不受胰蛋白酶的影響。食物中的腸毒素耐熱性更強(qiáng)，一般烹調(diào)溫度不能將其破壞。 的油中需才能被破壞。可引起急性胃腸炎。根據(jù)腸毒素的血清型，可分、（、）、 個(gè)型。型腸毒素引起的食物中毒較多，約占左右。其他依次為、和型。也有、等。耐熱，經(jīng)煮沸不被破壞，也不受胰蛋白酶的影響。食物中的腸毒素型腸毒素毒力較強(qiáng)，攝入即可引起中毒；型毒力較弱攝入，才引起中毒。一般認(rèn)為引起人中毒的最小劑量是。型腸毒素毒力較強(qiáng)，攝入即可引起中毒；型毒力較弱攝入

5、，才引金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)金黃色葡萄球菌的檢測(cè)程序檢樣() 生理鹽水或磷酸鹽緩沖液氯化鈉肉湯或氯化鈉胰酪胨大豆肉湯平板，血平板涂片染色觀察溶血血漿凝固酶試驗(yàn)報(bào)告血平板， 平板或。肉湯和營(yíng)養(yǎng)瓊脂小斜面金黃色葡萄球菌的檢測(cè)程序檢樣() 生理鹽水或磷酸鹽緩沖液氯增菌培養(yǎng)基氯化鈉肉湯：為葡萄球菌選擇性增菌培養(yǎng)基，因金黃色葡萄球有耐受高鹽的特性，因而能在此增菌液中生長(zhǎng)，除某些嗜高鹽的海洋菌外，大多數(shù)細(xì)菌都被增菌液中的高鹽所抑制。胰酪胨大豆肉湯：含氯化鈉達(dá)，以胰酪胨替代牛肉浸粉，并加入少量磷酸氫二鉀和葡萄糖促進(jìn)葡萄球菌的生長(zhǎng)。增菌培養(yǎng)基氯化鈉肉湯：為葡萄球菌選擇性增菌培養(yǎng)基，因金黃色葡樣品

6、的稀釋固體和半固體樣品：稱取樣品至盛有 磷酸鹽緩沖稀釋液或生理鹽水的無(wú)菌均質(zhì)杯內(nèi)， 均質(zhì)，或放入盛有 稀釋液的無(wú)菌均質(zhì)袋中，用拍擊式均質(zhì)器拍打，制成的樣品勻液。液體樣品：以無(wú)菌吸管吸取樣品至盛有磷酸鹽緩沖稀釋液或生理鹽水的無(wú)菌錐形瓶(瓶?jī)?nèi)預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的無(wú)菌玻璃珠)中，充分混勻，制成的樣品勻液。 樣品的稀釋固體和半固體樣品：稱取樣品至盛有 磷酸鹽緩沖稀釋液增菌與分離培養(yǎng)增菌培養(yǎng)：吸取上述樣品勻液，接種于 氯化鈉肉湯或胰酪胨大豆肉湯培養(yǎng)基內(nèi)，培養(yǎng)。金黃色葡萄球菌在氯化鈉肉湯中呈混濁生長(zhǎng)，污染嚴(yán)重時(shí)在胰酪胨大豆肉湯內(nèi)呈混濁生長(zhǎng)。 將上述培養(yǎng)物，分別劃線接種到平板和血平板，血平板培養(yǎng)。平板培養(yǎng)或。 增

7、菌與分離培養(yǎng)增菌培養(yǎng)：吸取上述樣品勻液，接種于 氯化鈉肉湯分離培養(yǎng)基瓊脂：培養(yǎng)基中含有卵黃亞碲酸鉀，能抑制大多數(shù)細(xì)菌的繁殖，并能促進(jìn)金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)使其產(chǎn)生黑色和暈圈。培養(yǎng)基中的丙酮酸鈉和甘氨酸也能促進(jìn)金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)。金黃色葡萄球菌的菌落形態(tài)：圓形、光滑凸起、濕潤(rùn)，直徑約，顏色呈灰色到黑色，邊緣為淡色，周圍為一混濁帶，在其外層有一透明圈。用接種針接觸菌落似有奶油樹膠的硬度，偶而可見(jiàn)無(wú)混濁帶和透明圈的非典型菌落。分離培養(yǎng)基瓊脂：培養(yǎng)基中含有卵黃亞碲酸鉀，能抑制大多數(shù)細(xì)菌的長(zhǎng)期保存的冷凍或干燥食品中所分離的菌落比典型菌落所產(chǎn)生的黑色較淡些，外觀可能粗糙并干燥。長(zhǎng)期保存的冷凍或干燥食品中所

8、分離的菌落比典型菌落所產(chǎn)生的黑色金黃色葡萄球菌空白培養(yǎng)基培養(yǎng)基 用途 測(cè)試菌株參考培養(yǎng)基控制方法判定標(biāo)準(zhǔn)特性反應(yīng)生長(zhǎng)率金黃色葡萄球菌；金黃色葡萄球菌 定量黑色灰色菌落帶透明帶選擇性大腸埃希氏菌或 定性全部抑制特異性表皮葡萄球菌 定性黑色灰色菌落無(wú)透明帶金黃色葡萄球菌空白培養(yǎng)基培養(yǎng)基 用途 測(cè)分離培養(yǎng)基血瓊脂：是一種基礎(chǔ)培養(yǎng)基，含有的脫纖維血(羊血或兔血)。用于觀察金黃色葡萄球菌的溶血現(xiàn)象。金黃色葡萄球菌在血瓊脂平板上呈溶血。金黃色葡萄球菌的菌落形態(tài)：呈金黃色，有時(shí)也呈白色，大而突起，圓形、不透明、表面光滑，周圍有透明的溶血環(huán)。分離培養(yǎng)基血瓊脂：是一種基礎(chǔ)培養(yǎng)基，含有的脫纖維血(羊血或兔金黃色葡

9、萄球菌的重要鑒定血漿凝固酶試驗(yàn) 試驗(yàn)原理：致病性的金黃色葡萄球菌產(chǎn)生的血漿凝固酶，使血漿中纖維蛋白原轉(zhuǎn)變?yōu)槔w維蛋白，附著于細(xì)菌表面 ，產(chǎn)生凝固。金黃色葡萄球菌可產(chǎn)生兩種凝固酶：一種是與細(xì)胞壁結(jié)合的凝固酶，為結(jié)合凝固酶；另一種是菌細(xì)胞釋放于培養(yǎng)基中，為游離凝固酶。二者的抗原性不同。金黃色葡萄球菌的重要鑒定血漿凝固酶試驗(yàn) 試驗(yàn)原理：致病性的血漿凝固酶試驗(yàn) 挑取平板或血平板上可疑菌落個(gè)或以上，分別接種到 和營(yíng)養(yǎng)瓊脂小斜面，培養(yǎng) 。 取新鮮配置兔血漿，放入小試管中，再加入可疑菌落的培養(yǎng)物，振蕩搖勻，置溫箱或水浴箱內(nèi)，每半小時(shí)觀察一次，觀察，如呈現(xiàn)凝固（即將試管傾斜或倒置時(shí)，呈現(xiàn)凝塊）或凝固體積大于原體

10、積的一半，判定為陽(yáng)性結(jié)果。 血漿凝固酶試驗(yàn) 挑取平板或血平板上可疑菌落個(gè)或以上，分別接同時(shí)以血漿凝固酶試驗(yàn)陽(yáng)性和陰性葡萄球菌菌株的肉湯培養(yǎng)物作為對(duì)照。 結(jié)果如可疑，挑取營(yíng)養(yǎng)瓊脂小斜面的菌落到 ，培養(yǎng)，重復(fù)實(shí)驗(yàn)。 同時(shí)以血漿凝固酶試驗(yàn)陽(yáng)性和陰性葡萄球菌菌株的肉湯培養(yǎng)物作為對(duì)結(jié)果報(bào)告如血漿凝固酶試驗(yàn)陽(yáng)性，可判定為金黃色葡萄球菌 。報(bào)告在（）樣品中檢出或未檢出金黃色葡萄球菌。結(jié)果報(bào)告如血漿凝固酶試驗(yàn)陽(yáng)性，可判定為金黃色葡萄球菌 。影響血漿凝固酶試驗(yàn)的因素血漿：血漿凝固酶試驗(yàn)可選用人血漿或兔血漿。用人血漿出現(xiàn)凝固的時(shí)間短，約的陽(yáng)性菌在內(nèi)出現(xiàn)凝固。用兔血漿內(nèi)出現(xiàn)凝固的陽(yáng)性菌株僅達(dá)，大部分菌株可在內(nèi)出現(xiàn)凝

11、固。若被檢菌為陳舊的培養(yǎng)物（超過(guò)），或生長(zhǎng)不良，可能造成凝固酶活性低，出現(xiàn)假陰性。影響血漿凝固酶試驗(yàn)的因素血漿：血漿凝固酶試驗(yàn)可選用人血漿或兔不能使用甘露醇氯化鈉瓊脂上的菌落做血漿凝固酶的實(shí)驗(yàn)，因所有高鹽培養(yǎng)基都可以抑制蛋白的產(chǎn)生，造成假陰性結(jié)果。不要用力振搖試管，以免凝塊振碎。實(shí)驗(yàn)必需設(shè)陽(yáng)性(標(biāo)準(zhǔn)金黃色葡萄球菌)、陰性(白色葡萄球菌)、空白(肉湯)對(duì)照。玻片法只能檢測(cè)結(jié)合凝固酶，而試管法可檢測(cè)兩種凝固酶。因此，兩種試驗(yàn)所得結(jié)果可完全不同。玻片法只用于篩選。不能使用甘露醇氯化鈉瓊脂上的菌落做血漿凝固酶的實(shí)驗(yàn)，因所有高 金黃色葡萄球菌計(jì)數(shù) 金黃色葡萄球菌計(jì)數(shù)第一法 平板法第二法法第三法測(cè)試片法第

12、一法 平板法第一法:平板計(jì)數(shù)法第一法:平板計(jì)數(shù)法檢驗(yàn)程序檢樣() 生理鹽水或磷酸鹽緩沖液倍稀釋選擇三個(gè)連續(xù)的適宜濃度的樣品勻液，接種平板計(jì)數(shù)及血漿酶試驗(yàn)報(bào)告檢驗(yàn)程序檢樣() 生理鹽水或磷酸鹽緩沖液倍稀釋選擇三個(gè)連續(xù)樣品的接種、培養(yǎng)與典型菌落的確認(rèn)根據(jù)對(duì)樣品污染狀況的估計(jì)，選擇個(gè)適宜稀釋度的的樣品勻液(液體樣品可包括原液)，每個(gè)稀釋度分別吸取，以，接種量，分別加入三塊平板，用棒涂布整個(gè)平板，(注意不要觸及平板的邊緣)。接種前應(yīng)注意保持平板的干燥(可在的培養(yǎng)箱中干燥)，通常情況下涂布后，將平板靜置，如樣液不易吸收，可將平板置培養(yǎng)后，再反轉(zhuǎn)平板，倒置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)。培養(yǎng)溫度與時(shí)間：，。典型菌落確認(rèn)：從

13、典型菌落中任選五個(gè)菌落（小于五個(gè)全選），分別接種到和營(yíng)養(yǎng)瓊脂小斜面，培養(yǎng)后進(jìn)行血漿凝固酶試驗(yàn)。樣品的接種、培養(yǎng)與典型菌落的確認(rèn)根據(jù)對(duì)樣品污染狀況的估計(jì)，選典型菌落計(jì)數(shù)與計(jì)算公式的應(yīng)用計(jì)數(shù)范圍要求：選擇合計(jì)菌落數(shù)在的平板，計(jì)數(shù)典型菌落。典型菌落計(jì)數(shù)與計(jì)算公式的應(yīng)用計(jì)數(shù)范圍要求：選擇合計(jì)菌落數(shù)在的公式一的使用范圍：最低稀釋度平板的菌落小于 ，計(jì)數(shù)該稀釋度平板上的典型菌落；某一稀釋度平板的菌落大于 且有典型菌落，但上一稀釋度平板上沒(méi)有典型菌落，計(jì)數(shù)該稀釋度平板上的典型菌落；某一稀釋度平板的菌落大于 且有典型菌落，且上一稀釋度平板上有典型菌落，其平板上的菌落數(shù)不在 之間，計(jì)數(shù)該稀釋度平板上的典型菌落；

14、公式一的使用范圍：公式一 :樣品中金黃色葡萄球菌落數(shù)； :某一稀釋度典型菌落的總數(shù) ；:某一稀釋度血漿凝固酶陽(yáng)性的菌落數(shù) ；:某一稀釋度用于血漿凝固酶試驗(yàn)的菌落數(shù)； :某一稀釋度。 公式一 公式應(yīng)用例一 公式一： 樣品稀釋度典型菌落數(shù)，用于做血漿凝固酶菌落數(shù)血漿凝固酶陽(yáng)性菌落數(shù)高、低稀釋度平板均有典型菌落，但其中高稀釋度二平板的菌落數(shù)均不在之間，選擇低稀釋度的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)。公式應(yīng)用例一 公式一： 樣品稀釋度典型 ：兩個(gè)稀釋度平板上確認(rèn)的金黃色葡萄球菌菌落總數(shù)之和； ：稀釋因子(第一稀釋度)。公式二的使用范圍：平板菌落數(shù)均在 之間。公式引用于 ()公式二 公式二公式應(yīng)用例二 公式二： 樣品稀釋度

15、典型菌落數(shù)，用于做血漿凝固酶菌落數(shù)血漿凝固酶陽(yáng)性菌落數(shù)所有稀釋度平板合計(jì)菌落數(shù)均在間：公式應(yīng)用例二 公式二： 樣品稀釋度典型菌落數(shù)，用結(jié)果報(bào)告單位：或者；若或者為，報(bào)告 ()。結(jié)果報(bào)告單位：或者；若或者為，報(bào)告或的出現(xiàn)。方便表的查找。注意要點(diǎn)法適用于金黃色葡萄球菌含量較低而雜菌含量較高的食品。第三法測(cè)試片法第三法測(cè)試片法適用范圍測(cè)試片法適用于肉及其制品，奶制品等。適用范圍測(cè)試片法適用于肉及其制品，奶制品等。測(cè)試片法檢驗(yàn)程序檢樣()稀釋，勻質(zhì)，倍系列稀釋選擇適宜稀釋度的樣品勻液，各取分別加入紙片判讀沒(méi)有菌落只有典型紫紅色菌落將所有紫紅色菌落計(jì)數(shù)為金黃色葡萄球菌除典型紫紅色菌落外其他顏色的菌落加入

16、確認(rèn)反應(yīng)片， ，培養(yǎng)有粉紅色菌暈的菌落計(jì)數(shù)為金黃色葡萄球菌報(bào)告測(cè)試片法檢驗(yàn)程序檢樣()稀釋，勻質(zhì)，倍系列稀釋選擇適宜稀釋度第三法 測(cè)試片法金黃色葡萄球菌測(cè)試片，含具有顯色功能、經(jīng)改良的培養(yǎng)基，對(duì)金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)有很強(qiáng)的選擇。金黃色葡萄球菌在測(cè)試片上生成為暗紫紅色的菌落，可以直接完成鑒定和計(jì)數(shù)。第三法 測(cè)試片法金黃色葡萄球菌測(cè)試片，含具有顯色功能、經(jīng)改良金黃色葡萄球菌確認(rèn)反應(yīng)片金黃色葡萄球菌確認(rèn)反應(yīng)片含有顯色劑和耐熱去氧核糖核酸()，金黃色葡萄球菌可生產(chǎn)耐熱酶，此酶與反應(yīng)片上的顯色劑反應(yīng)，形成粉紅色環(huán)。而其他細(xì)菌因不產(chǎn)生耐熱酶沒(méi)有該反應(yīng)。但在葡萄球菌屬中，豬葡萄球菌、中間葡萄球菌也會(huì)產(chǎn)生陽(yáng)性反應(yīng)。金黃色葡萄球菌確認(rèn)反應(yīng)片金黃色葡萄球菌確認(rèn)反應(yīng)片含有顯色劑和計(jì)數(shù)與結(jié)果報(bào)告菌落計(jì)數(shù): 到培養(yǎng)時(shí)間應(yīng)立即計(jì)數(shù)，可目視、或用放大鏡輔助計(jì)數(shù)；選取菌落數(shù)在之間的測(cè)試片作為計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)。選擇菌落數(shù)在之間的稀釋度，乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告之；如果所有稀釋度測(cè)試片上的菌落數(shù)都小于， 則計(jì)數(shù)稀釋度最