霍亂弧菌實驗室檢測課件

1、霍亂弧菌的實驗室檢測霍亂弧菌實驗室檢測霍亂弧菌的實驗室檢測霍亂弧菌實驗室檢測目的:提高檢出率,減少漏檢以及誤判的發(fā)生手段: 檢測人員是否有足夠的責(zé)任心? 檢測試劑準備是否齊全且符合要求? 是否嚴格按照檢測流程進行操作?霍亂弧菌實驗室檢測目的:提高檢出率,減少漏檢以及誤判的發(fā)生霍亂弧菌實驗室檢測 什么是霍亂? 霍亂是由01群和0139群霍亂弧菌（Vcholerae）引起的急性腸道傳染病，發(fā)病急、傳播速度快、波及范圍廣、危害嚴重的甲類傳染病。霍亂概述 古典生物型 小川型 Ogawa (AB) O1群 稻葉型 Inaba (AC) 埃爾托生物型 彥島型 Hikojim (ABC)霍亂弧菌 霍亂病原菌

2、 O139群（Bengal） 非O1群 O2-O200群 腹瀉病原菌霍亂弧菌實驗室檢測 什么是霍亂?霍亂概述 病原體 O1群，O139群霍亂弧菌發(fā)病特征： 劇烈腹瀉、嘔吐、嚴重脫水時致酸中毒、循環(huán)衰竭而致死亡 不治療或醫(yī)療很差的條件下病死率可達到2050（重癥病人達70100） 培養(yǎng)特性： 營養(yǎng)要求不高，兼性厭氧，37生長，怕酸嗜堿， pH:7.4-9.6快速生長檢驗依據(jù)： WS 289-2008 霍亂診斷標準 霍亂防治手冊（1999年第五版）霍亂弧菌實驗室檢測病原體 霍亂弧菌實驗室檢測 霍亂的實驗室檢測 樣品的采集和運輸不同樣品的病原分離流程及技術(shù)要點 糞便 水體 水產(chǎn)品，食品等平板分離及可

3、疑菌落挑取菌落鑒定常用快速檢測方法 膠體金檢測條 熒光PCR檢測檢測工作中應(yīng)關(guān)注的事項 霍亂弧菌實驗室檢測 霍亂的實驗室檢測霍亂弧菌實驗室檢測 樣品的采集和運輸采集： 病例：糞便、肛拭子、嘔吐物 未使用抗生素之前 “健康”人：糞便、肛拭子 其他傳播環(huán)節(jié)的標本：食物、水、環(huán)境類樣品 監(jiān)測：水樣，水產(chǎn)品等運輸：一般要求在3小時內(nèi)室溫（20-25 ）條件下送達實驗室檢測 C-B運輸培養(yǎng)基（pH8.4）; （或文臘二氏保存液） 堿性蛋白胨水（pH8.4-9.2） ：不是最佳的，尤其6小時內(nèi)還不能進行培養(yǎng)時，盡量采用 C-B運輸培養(yǎng)基?；魜y弧菌實驗室檢測 樣品的采集和運輸霍亂弧菌實驗室檢測糞便的采集與保

4、存運送 以采集病人自然排除的新鮮糞便為主，水樣便采取13mL，成形便采取指甲大小的糞量，亦可用直腸棉拭或采便管由肛門插入直腸內(nèi)35cm處采取，采集后的樣品應(yīng)盡快挑取接種于堿性蛋白胨水（8.-9.2），同時劃線分離選擇性培養(yǎng)基（慶大四號平板），如不能在小時內(nèi)送達實驗室檢測的樣品，應(yīng)插入Cary-Blair二氏半固體保存培養(yǎng)基（或文臘二氏保存液）中送檢。標本與保存液比例約為15。分離培養(yǎng)要點（兩管三板法）： 挑取糞便，直接接種于堿性蛋白胨水（第一管）中，同時劃線分離選擇性平板（慶大四號平板，第一板）。 第一管堿性蛋白胨水在 增菌小時，沾取菌膜下表層液體，劃線分離選擇性平板（慶大四號平板，第二板），

5、同時吸取0.10.2 ml表層培養(yǎng)物，接種堿性蛋白胨水（第二管）。 第二管堿性蛋白胨水增菌小時后劃線分離選擇性平板（慶大四號平板，第三板）。 糞便分離流程及技術(shù)要點霍亂弧菌實驗室檢測糞便的采集與保存運送 糞便分離流程及技術(shù)要點霍亂弧菌實驗室水體的采集與保存運送 水體的采集一般用無菌的500ml水樣瓶采集相對靜止的表層水(深度為 30cm以內(nèi))500ml，密封加蓋后于室溫（20-25 ）3小時內(nèi)送達實驗室檢測。分離培養(yǎng)要點（十倍濃縮堿胨水增菌培養(yǎng)法）： 取450ml水樣，用1M 氫氧化鈉調(diào)整至pH 8.4-9.2。然后加10倍濃縮堿性胨水50ml。再加入1%亞碲酸鉀0.250.5 ml和1000

6、單位/ ml青霉素1 ml。37培養(yǎng)過夜，取菌膜下表層培養(yǎng)物接種選擇性培養(yǎng)基（慶大四號平板）分離培養(yǎng)，同時吸0.10.2 ml表層培養(yǎng)物轉(zhuǎn)種于堿性胨水管中作二次增菌，37培養(yǎng)68h再劃線接種于選擇性培養(yǎng)基（慶大四號平板）。 水體分離流程及技術(shù)要點霍亂弧菌實驗室檢測水體的采集與保存運送 水體分離流程及技術(shù)要點霍亂弧菌實驗室水產(chǎn)品的采集與保存運送 通常選取活的或者新鮮的水生動物為采集對象，有時也應(yīng)考慮冰凍的水生動物，有條件的采樣點可將水生動物整體采回實驗室再進行相關(guān)處置 涂抹采集： 使用無菌棉簽涂抹5只以上水水生動物表面、腮部及泄殖腔，直接接種到20ml堿性蛋白胨水作為增菌液處理。 整體或局部采集

7、： 在實驗室應(yīng)以無菌操作將其解剖，取鰓部和腸內(nèi)容物25克剪碎后，置滅菌均質(zhì)杯或均質(zhì)袋中，加入225mL倍體積的堿性蛋白胨水增菌；但小貝殼類動物，則用錘子將外殼擊碎，整體放入100ml三角瓶中，加入5-10倍的堿性蛋白胨水增菌；甲殼類動物除含肉質(zhì)部分外，其余部分(包括鰓、腸、足、表層外殼等)整體放入100ml三角瓶中，加入5-10倍的堿性蛋白胨水增菌。分離培養(yǎng)（兩管兩板法）： 接種后的堿性蛋白胨水37培養(yǎng)過夜，取菌膜下表層培養(yǎng)物接種選擇性培養(yǎng)基（慶大四號平板）同時吸0.10.2 ml表層培養(yǎng)物轉(zhuǎn)種于10ml堿性胨水管中作二次增菌，37培養(yǎng)68h再劃線接種于選擇性培養(yǎng)基（慶大四號平板）。 水產(chǎn)品分

8、離流程及技術(shù)要點霍亂弧菌實驗室檢測水產(chǎn)品的采集與保存運送水產(chǎn)品分離流程及技術(shù)要點霍亂弧菌實驗室霍亂弧菌實驗室檢測霍亂弧菌實驗室檢測平板分離 選擇性分離平板應(yīng)采用9cm分離平板（不建議采用7cm平板），一個平 板分離一個樣品（嚴禁一個平板分離2份或以上樣品！ ）。 樣品平板分離時應(yīng)進行分區(qū)劃線分離，平板分離的單個菌落數(shù)量應(yīng)該達到 50個以上?？梢删涮羧?經(jīng)典的鑒定步驟要求每個平板應(yīng)挑取5個以上可疑菌落,轉(zhuǎn)種于克氏雙糖斜面或者普通瓊脂斜面待分純培養(yǎng)后,再進行O1、O139群血清玻片凝集試驗，鑒于對霍亂疫情應(yīng)急處理的考慮,現(xiàn)大多數(shù)監(jiān)測實驗室一般采用將血清玻片凝集試驗前置的做法,作為快速篩查的手段,

9、直接對平板上生長的單個可疑菌落進行玻片凝集試驗,出現(xiàn)明顯凝集時可做初步報告,對平板上出現(xiàn)可疑凝集的菌株必須馬上轉(zhuǎn)種于克氏雙糖斜面或者普通瓊脂斜面,待純培養(yǎng)物生長良好后再次進行玻片凝集試驗加以確證。 慶大霉素平板和4號瓊脂：多呈半透明狀，菌落中央常呈灰色或灰黑色，并隨培養(yǎng)時間的延長而加深（由于這類培養(yǎng)基均含有亞碲酸鹽成份）。 TCBS（硫代硫酸鹽枸櫞酸鹽膽鹽瓊脂）：菌落生長呈黃色發(fā)亮、表面光滑、潤濕、稍凸起、邊緣整齊。 （TCBS平板生長的菌落不能直挑取進行玻片凝集試驗，需按經(jīng)典方法進行純培養(yǎng)后再進行玻片凝集試驗） 平板分離及可疑菌落挑取霍亂弧菌實驗室檢測平板分離平板分離及可疑菌落挑取霍亂弧菌實

10、驗室檢測霍亂弧菌實驗室檢測霍亂弧菌實驗室檢測染色鏡檢 革蘭染色陰性的短桿菌血清凝集試驗： 分別使用O1群，O139群霍亂血清進行凝集試驗，同時使用生理鹽水進行對照凝集，以排除與生理鹽水發(fā)生凝集的自凝菌。 生理鹽水不凝集，O1群血清明顯凝集的菌落，進一步使用稻葉型和小川型血清進行凝集試驗，判定型別：稻葉型血清凝集而小川型血清不凝集的菌落為稻葉型，小川型血清凝集而稻葉型血清不凝集的菌落為小川型，如稻葉型血清和小川型血清均出現(xiàn)凝集的時候，要注意鑒別是否為彥島型，需進行試管凝集試驗且兩者的凝集效價均超過一半以上才能判定為彥島型，因為某些小川型菌落自身會帶有少量的C抗原而出現(xiàn)與稻葉型血清發(fā)生弱凝集，因此

11、如小川型血清凝集較稻葉型血清凝集有明顯優(yōu)勢時應(yīng)維持小川型的判定。 生理鹽水不凝集，O139群血清明顯凝集的菌落，一般為O139群，但其與O22群及O155群甚至一些非霍亂弧菌會出現(xiàn)交叉凝集，由上級實驗室進行進一步確認。 菌落鑒定霍亂弧菌實驗室檢測菌落鑒定霍亂弧菌實驗室檢測O1群和O139群抗原構(gòu)造與血清分型 型 別 群特異性抗原型特異性抗原AO139BC 小川+少量 稻葉+ 彥島+ O139 +霍亂弧菌實驗室檢測O1群和O139群抗原構(gòu)造與血清分型 群特異性抗原型特異性抗國內(nèi)商品化的霍亂檢測血清國外血清：日本生研，泰國S&A血清等霍亂弧菌實驗室檢測國內(nèi)商品化的霍亂檢測血清霍亂弧菌實驗室檢測進一

12、步實驗氧化酶試驗1鹽酸對氨基二甲基苯胺或鹽酸二甲基對苯二胺水溶液 粘絲試驗0.5去氧膽酸鈉水溶液 霍亂弧菌實驗室檢測進一步實驗氧化酶試驗粘絲試驗霍亂弧菌實驗室檢測生化鑒定 生化鑒定管： 發(fā)酵葡萄糖、甘露醇、 蔗糖、產(chǎn)酸不產(chǎn)氣 能分解色氨酸 賴氨酸、鳥氨酸脫羧酶（+） 精氨酸雙水解酶（-） 霍亂弧菌生化鑒定管（11種生化,套裝，環(huán)凱）； 生化鑒定條：梅里埃API 20E鑒定條等 全自動生化檢測儀檢測：梅里埃VITEK2 COMP 全自動生化鑒定卡等進一步分型鑒定(省CDC進行) 噬菌體分型 PFGE脈沖場分型 進一步實驗霍亂弧菌實驗室檢測生化鑒定 進一步實驗霍亂弧菌實驗室檢測針對原始樣品（如病人

13、糞便）以及初始增菌后的菌液進行快速檢測膠體金快速檢測卡 O1群霍亂膠體金標記快診卡 O139群霍亂膠體金標記快診卡熒光PCR快速檢測試劑盒 O1群、 O139群雙色熒光檢測試劑盒 霍亂CTX毒力基因熒光檢測試劑盒注：快速檢測并不能替代常規(guī)檢測的進行，只是作為輔助檢測的一種手段霍亂快速檢測技術(shù)的應(yīng)用霍亂弧菌實驗室檢測霍亂快速檢測技術(shù)的應(yīng)用霍亂弧菌實驗室檢測霍亂弧菌膠體金免疫層析檢測霍亂弧菌實驗室檢測霍亂弧菌膠體金免疫層析檢測霍亂弧菌實驗室檢測 熒光PCR檢測霍亂弧菌病例標本檢測環(huán)境和食品調(diào)查的初篩方法O1群、 O139群雙色熒光檢測試劑盒 深圳生科源生物技術(shù)有限公司霍亂弧菌實驗室檢測 熒光PCR檢測霍亂弧菌O1群O1群和O139群霍亂弧菌的檢驗程序鑒定分型確診報告膠體金、熒光PCR快速診斷增菌培養(yǎng)（堿胨水）分離培養(yǎng)慶大霉素、4號、TCBS瓊脂標本（糞便等）玻片凝集陽性（結(jié)合菌落、菌體形態(tài)）凝集菌落或可疑菌落純培養(yǎng)（營養(yǎng)瓊脂或克氏雙糖培養(yǎng)）第二次增菌（堿胨水）初步報告10-20小時6-8小時10-20小時直接霍亂弧菌實驗室檢測O1群和O139群霍亂弧菌的檢驗程序鑒定確診報告膠體金、增菌 檢測工作中應(yīng)關(guān)注的事項 生物安全與個人防護（生物安全2級實驗室操作