中藥全球化、國際化的必由之路

1、1中藥全球化、國際化的 必由之路2中醫(yī)藥學是傳統(tǒng)醫(yī)藥學的一個重要組成部分一切古老的民族都有自己的傳統(tǒng)醫(yī)學，但傳統(tǒng)醫(yī)學在多數(shù)近代醫(yī)學發(fā)達的西方國家已經(jīng)基本消失；現(xiàn)今，世界仍然保存著的三大傳統(tǒng)醫(yī)學體系： 1、希臘傳統(tǒng)醫(yī)學體系 原先幾乎在整個歐洲、以及非洲北部到印度亞大陸一帶均十分普及，現(xiàn)在則只能在伊斯蘭各國可以看到； 2、印度傳統(tǒng)醫(yī)學體系 現(xiàn)在僅在印度一帶可以見到； 3、中國傳統(tǒng)醫(yī)學體系 包括日本、韓國、北朝鮮等周邊國家和地區(qū)。在中國 及世界華人文化圈系里尤其根深蒂固；3傳統(tǒng)中藥是中國天然藥物的主體傳統(tǒng)中藥是中國天然藥物（傳統(tǒng)中藥、民間藥、民族藥、國外傳入藥材）的主體，在臨床醫(yī)療中起的作用最大，對

2、中華民族的繁衍昌盛起了不可磨滅的貢獻。其數(shù)量有據(jù)可查者約6,000種。 本草綱目(明, 李時珍) 收載 1892 種 本草綱目拾遺(清, 趙學敏)增補 1021 種 中藥大詞典 收載 5767 種傳統(tǒng)中藥凝聚了中華民族幾千年的寶貴經(jīng)驗，不僅是中國的寶貴財富，也是世界文化的重要遺產(chǎn)，是我國最有可能對世界做出重要貢獻的一個領域。據(jù)統(tǒng)計，現(xiàn)今在中國，常用和較常用中藥大約有500余種，由其組成的復方制劑（俗稱“方劑”），已經(jīng)作為藥品批準生產(chǎn)、并在臨床應用的約有26種劑型、近1萬個品種；4傳統(tǒng)醫(yī)藥學的發(fā)生和發(fā)展是個經(jīng)驗積累過程自從200萬年前人類在地球上出現(xiàn)之后，為了求得生存和發(fā)展、繁衍后代，在與自然界

3、斗爭過程中就開始伴隨出現(xiàn)了一系列的尋醫(yī)求藥活動。在當時條件下這些活動當然主要是通過親身實踐進行。在中國古籍中，“神農(nóng)嘗百草，一日而中七十毒”的記載就是其中最突出的一個例子。傳統(tǒng)醫(yī)藥學最初就是通過這種“以身試藥”、日積月累形成的一種經(jīng)驗醫(yī)學，隨著時間的推移和長期積累，人們將這些寶貴經(jīng)驗通過言傳身教、不斷總結整理，逐步提升，才形成了現(xiàn)在的傳統(tǒng)醫(yī)學。5經(jīng)驗醫(yī)藥學存在的主要缺陷真?zhèn)位齑?、魚目混珠、良璓不齊（原料藥材問題更突出）；臨床療效缺乏按照EBM（Evidence Based Medicine）原則（即：隨機分組、雙盲對照、多點觀察）提供的科學試驗數(shù)據(jù)；作為經(jīng)驗醫(yī)學，保留下來的常用、較常用藥物多數(shù)

4、為中藥中的上品和中品，作用比較緩和，用藥方法及劑型也比較局限；多數(shù)中藥/制劑的作用靶點和作用物質(zhì)基礎不清楚；不少經(jīng)驗能否從“個性”上升為“共性”，從“特殊性”上升為“普遍性”有待進一步研究證實；與之相應，缺乏嚴格的質(zhì)量監(jiān)控標準以及國際公認的知識產(chǎn)權保護等等。以上這些問題如果不能及時用現(xiàn)代科學方法加以研究解決，做到與時俱進，不僅將會嚴重影響中藥制劑產(chǎn)品的質(zhì)量，也將成為制約傳統(tǒng)中藥走向國際市場的重要障礙。6中藥的治療作用多具有適應多樣性的特點中藥多組方應用，謂之方劑。中藥以麻黃為例，經(jīng)過辯證組合可以組成不同的方劑，如：小青龍湯、麻黃湯、麻杏石甘湯、麻黃附子細辛湯、葛根湯等，作用各異，分別用于治療不

5、同的疾病。這說明中藥作用具有適應多樣性的特點；中醫(yī)還有“同病異治”及“異病同治”的說法，更加證明了中藥作用的適應多樣性；7中藥、天然藥物防治疾病的物質(zhì)基礎所含的活性成分麻黃素（l-Ephedrine)(麻黃，平喘)紫杉醇（Taxol)(紫杉，抗腫瘤青蒿素（Qinhaosu)(青蒿，抗瘧疾）咖啡因（Caffeine)(咖啡、茶，興奮中樞）嗎啡（Morphine)(罌粟乳汁，麻醉、鎮(zhèn)痛）8中藥作用的適應多樣性來源于所含成分的多樣性 中藥或天然藥物名稱 生理活性活性篩選體系 目標活性物質(zhì) 烏頭 (Aconitum spp.)強心、利尿興奮、鎮(zhèn)痛Yagi-Hartung法（離體蛙心）鎮(zhèn)痛活性模型 去甲

6、基烏藥堿 （Higenamine) 烏頭堿類大黃（Rheum coreanum及R. palmatum的雜交種）健胃、緩瀉 致瀉活性(小鼠) 番瀉苷 (sennoside) 茵陳蒿 (Artemisia capillaris) 利膽、抗炎 膽汁分泌促進作用 茵陳色原酮 (capillarisin)等 貝(日本產(chǎn)) (Babylonia japonica) 口渴、視力減退、瞳孔散大、言語障礙、便秘 atropine定量法（小鼠散瞳率試驗) surugatoxin 軟紫草 (Arnebia euchroma) 止血、抗炎、抗菌、抗病毒、抗癌前列腺素PGE2生合成抑制活性 腫瘤細胞抑制活性arneb

7、inolarnibinone arnebifuranone shikonins類9全面闡明中藥/制劑防治疾病的作用靶標與作用物質(zhì)是個艱巨的過程中藥方劑紅色：活性成分淺藍色：毒副作用成分人體內(nèi)分泌系統(tǒng)神經(jīng)系統(tǒng)免疫系統(tǒng)消化系統(tǒng)呼吸系統(tǒng)器 官作用靶點 ？組 織細 胞基 因10加入WTO后，中國傳統(tǒng)醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)面臨嚴峻的挑戰(zhàn)從2001年11月中國正式加入WTO后，中國政府已經(jīng)采取有力措施，大大加強了對知識產(chǎn)權的保護力度。2002年12月出臺的新的藥品注冊辦法已經(jīng)進行了重大修改，強調(diào)申報新藥注冊必須說明有關知識產(chǎn)權情況的說明，提交未侵犯他人知識產(chǎn)權的書面保證。專利產(chǎn)品的隨意仿制遭到絕對禁止。中藥產(chǎn)品目前存在

8、多種保護制度共存的局面。在加入WTO后，多種保護共存的局面將不會長久持續(xù)下去。專利制度必將全面取代其他行政保護制度。新的形勢變化對中國傳統(tǒng)醫(yī)藥工業(yè)及創(chuàng)新藥物研究的發(fā)展和戰(zhàn)略決決策已經(jīng)帶來了重大的影響。11多數(shù)中藥制劑產(chǎn)品目前缺乏國際公認的知識產(chǎn)權保護以廣藥集團為例，據(jù)稱：年銷售額單品種超過1億元的，有4個品種年銷售額單品種超過5000萬元的，有10個品種年銷售額單品種超過1000萬元的有40個品種總計，集團賴以生存、運轉(zhuǎn)和發(fā)展靠的是這55個品種、14億元目前靠的是國內(nèi)的行政保護新藥保護及中藥品種保護等，基本上沒有國際公認的知識產(chǎn)權保護。一旦這些保護消失，集團將處于難以為繼的局面。最近列為廣州市

9、中藥二次研究開發(fā)重點的三個清熱解毒類名優(yōu)中成藥：清熱消炎寧、利膽消炎片、抗病毒口服液均非獨家生產(chǎn)，又無專利保護，雖然目前效益還算可以，但均面臨嚴峻挑戰(zhàn)；12中國醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)發(fā)展的必然趨勢國家知識產(chǎn)權戰(zhàn)略研究最近開始啟動，知識產(chǎn)權的保護將會得到進一步加強； 中藥現(xiàn)代化研究工作將提到重要的議事日程；中藥現(xiàn)代化的重點將是優(yōu)先加強對已有那些臨床療效確切、市場銷售前景看好、但作用靶標/機理及作用物質(zhì)不清、沒有知識產(chǎn)權保護的中藥產(chǎn)品的二次研究開發(fā)工作；創(chuàng)新藥物研究開發(fā)的層次將會大幅度提高： 處方雷同、沒有新意、技術含量低的品種將不會再得到批準； 政府和企業(yè)對創(chuàng)新藥物源頭研究的關心和支持力度將會加大，將會通過政

10、策調(diào)整和加大知識產(chǎn)權保護力度支持自主創(chuàng)新研究； 社會力量將會重新整合、分工，以利優(yōu)勢互補，形成合理的產(chǎn)業(yè)鏈結構； 醫(yī)藥企業(yè)將會重新調(diào)整、構建自己新的戰(zhàn)略合作伙伴關系；13中藥制劑標準化和國際化的重要途徑采用現(xiàn)代科學方法，科學闡明臨床有效中藥制劑治療疾病的作用靶點和與之相應的作用物質(zhì)基礎；制定嚴格、客觀可信的質(zhì)量監(jiān)控標準和方法，在原有產(chǎn)品基礎上升級換代成擁有自主知識產(chǎn)權的新一代產(chǎn)品；或者大幅度提升產(chǎn)品的質(zhì)量監(jiān)控標準，建立高技術壁壘，以利保護中藥產(chǎn)品的利益；- 以上工作是中藥制劑標準化和國際化的重要前提，也是中藥產(chǎn)品可能獲得專利保護的重要依據(jù)。 14中藥、天然藥物活性成分研究 通常采用的方法注意區(qū)

11、別下列概念 一般化學成分 活性成分（或生理活性成分） 有效成分（或藥效成分） 指標成分（用于質(zhì)量監(jiān)控的成分）如：麻黃中的麻黃素，甘草中的甘草酸等）；工作重點放在尋找其中的活性成分。主要采用生物活性指導下的靶向追蹤分離方法，分離追蹤其中對某個靶標具有活性的成分FractionationExtractionCrude drugBioactive compoundsPharmacological testPurification15從中藥黑果黃皮中分離得到的抗癌活性化合物NHR3R1R2R5R6R41: R3=CH3, R1=R2=R4=R5=R6=H2: R3=CH2OCH3, R1=R2=R4=

12、R5=R6=H3: R3=CHO, R1=R2=R4=R5=R6=H4: R1=OCH3, R3=CH3, R2=R4=R5=R6=H5: R1=OCH3, R3=CH2OCH3, R2=R4=R5=R6=H6: R1=OCH3, R3=CHO, R2=R4=R5=R6=H7: R1=OH, R3=CHO, R2=R4=R5=R6=H8: R1=OCH3, R3=COOH, R2=R4=R5=R6=H9: R2=OH, R3=CH3, R1=R4=R5=R6=H10: R1=OH, R3=CHO, R4=OCH3, R2-R5=R6=H11: R1=OH, R3=CHO, R5=OCH3, R

13、2=R4=R6=H12: R1=H, R2=OH, R3=CH3, R4=OCH3, R5=CHO13: R1=OH, R2=H, R3=CHO, R4=OCH3, R5=DMANHOCH3R1CH3CH3R214: R1= R2=H15: R1=OCH3, R2=OH16: R1=R2=OCH317: R1= OCH3, R2=H18: R1= H, R2=OCH319: R1=H , R2=OHNHOR1R2CH3R320: R1=CH3, R2=R3=H21: R1=CH3, R2=H, R3=OH22: R1=R3=H, R2=CHONHOOCH3R223: R=H24: R=OH25

14、: R=OCH326: R=HNHOOCH3NH27: R=CH3H3COCH3NOH29NHOCH3CH3CH3HOHNOH3CH3CH3COH28OCH3H3COCH3CH31617對市售抗前列腺增生中藥進行二次研究開發(fā)的基本思路專利申請市售抗BPH中成藥制劑活性品種原料調(diào)研，采集原料活性成分的追蹤分離活 性 成 分制劑成品確定指標成分,建立質(zhì)量控制體系結構修飾與改造體外多活性指標評價體內(nèi)實驗新藥開發(fā)抗BPH活性篩選體系18市售抗前列腺炎及前列腺增生中藥的銷售情況（南方醫(yī)藥經(jīng)濟研究所，中國藥品零售市場研究報告，2002年12月）19前列康原料-油菜花粉 為蕓香科植物油菜的花粉（Brassi

15、ca napus L. pollen） 藥理活性報道有：1) 對心血管方面疾病有療效2)治療前列腺炎及前列腺增生3) 對消化系統(tǒng)疾病有療效4)降低膽固醇和甘油三酯5)清除體內(nèi)過多自由基，減少氧化脂質(zhì)形成6)增強機體免疫功能7)抗腫瘤作用 前列康片劑由浙江康恩貝生產(chǎn)，用于治療前列腺增生和前列腺炎。目前在國內(nèi)市場有很好的銷量，在用于治療前列腺增生的中成藥領域中占主導地位。但是該藥服用劑量大、療程長、見效慢是其缺點。20從前列康中分離得到的活性化合物21從前列康中分離得到的活性化合物22在治療骨疾病復方中 出現(xiàn)頻率較高的中藥大鼠類成骨UMR106細胞的增殖為指標進行篩選體外篩選提示 陽性中藥體內(nèi)篩選

16、確 認陽性中藥文獻調(diào)研去卵巢大鼠體內(nèi)實驗大鼠類成骨UMR106細胞的增殖為指標進行活性成分追蹤分離化合物對UMR106細胞增殖的作用對UMR106細胞堿性磷酸酶的作用對UMR106細胞某些基因表達的作用對人乳腺癌細胞（MCF-7）增殖的作用從中藥中尋找抗骨質(zhì)疏松類活性成分的基本思路23接骨木（Sambucus williamsii Hance）接骨木為忍冬科植物Sambucus williamsii Hance的莖枝，又名戳樹、公道老樹等，分布于東北、華北、華中、華東、四川、云南等地，主產(chǎn)于江蘇。根及根皮、葉、花朵均供藥用。主要功用有祛風、活血、治風濕筋骨疼痛12?，F(xiàn)代藥理學研究方法表明，接骨

17、木屬植物具有抗病毒、抗菌、抗炎、抗氧化作用及免疫活性作用 13-17。12 江蘇新醫(yī)學院。中藥大辭典，上海科學技術出版社，2093。 13 V. Barak, T. Halperin, I. Kalickman. Eur. Cytokine Network 2001, 12(2): 290-296.14 N. E. Hernandez, M. L. Tereschuk, L. R. Abdala. J. Ethnopharmacol. 2000, 73(12): 317-322.15 M. Martinez-Vazquez, A. L. Lastra, A. Ramirez. Rev. Lat

18、inoam. Quim., 1997, 25(3): 126-127.16 N. Nakatani. Japanese Patent: JP 07101975 A2, 1995-4-18.17 希雨，國外醫(yī)藥植物藥分冊，2001，16（5）：202-204。24從接骨木中分離得到的化合物1 大黃素4 齊墩果酸7 松柏醛CH3-(CH2)14-COOH 9 十六烷酸2 R=CH2OH 白樺醇3 R=COOH 白樺酸8 R=COOH 熊果酸25 R=CH3 -香樹脂醇11 R1=OCH3, R2= H (-)-松脂素10 R1=H, R2= H (-)-丁香脂素24 R1=OCH3, R2= Gl

19、c 丁香脂素-4-O-D-葡萄糖苷 5 R1 =H, R2=H 香草醛6 R1 =H, R2 =CH3 香草乙酮12 R1 =OCH3, R2 =H 丁香醛1314 7, 8-ene 16 (-)-erytheo 17 (-)-threo 18 R=H (-)-落葉松脂醇42 R=OH (-)-olivil2519 R=CH3, (-)-(2S, 3R)47 R=H, (+)-(2R, 3S)20 erytheo 21 threo 2223 胡羅卜苷 26 豆甾醇 2728 rosononolactone29 boehmanen30 diospyrolide 31 R = OCH3,香草酸 3

20、8 R = H, 對羥基苯甲酸46 R =OH, 原兒茶酸2633 紅花菜豆酸34 N-甲基-丙氨酸酐35 hedyotisol 36 (-)-(1S, 2R)37 (-)-(2S, 3S)40 葛根素41 吲哚-3-羧酸43 （-）-1，4，13-三羥基-11（12）-桉烯 44 （-）-（9E）-8，11，12-三羥基-十八烷烯酸 45 （-）-（9E）-8，11，12-三羥基-十八烷烯酸甲酯 32 R = OCH3,阿魏酸 39 R =H, 對羥基桂皮酸27中藥活性成分研究的主要困難只用單一靶標活性篩選體系追蹤分離得到的活性物質(zhì)很難全面、合理說明中藥作用的適應多樣性和真正的作用物質(zhì)基礎；

21、采用多靶標同時進行活性物質(zhì)追蹤分離在實踐中又難于實現(xiàn)；對作用微弱或者含量微少的活性成分難于建立適當?shù)幕钚栽u價模型； 28采用多靶標、高通量活性篩選進行中藥活性成分研究勢在必行中藥、特別是復方研究，提倡采用多指標活性篩選體系進行活性成分的追蹤分離，但說起來容易，實踐起來卻十分困難；生命科學的進步使得人們有可能不斷闡明疾病防治的分子和細胞作用機制以及藥物作用的新靶標； 整體動物、系統(tǒng)、器官 組織、細胞 酶、受體、內(nèi)源性活性物質(zhì) 基因功能基因芯片的出現(xiàn)及應用有可能為此提供一種簡易、可行的初篩方法；29高通量篩選對提供的樣品有嚴格的要求中藥粗提取物難以適應高通量篩選要求 采用細胞、功能基因進行的高通量

22、篩選平臺對供試樣品的純度要求比較高。普通的中藥粗提取物因所含雜質(zhì)過多，常常得到假陽性或者假陰性結果而無法正確判斷，有時甚至無法進行測試；以純品形式提供中藥天然藥物成分難以實現(xiàn) 許多化學家提供的中藥天然藥物化學成分純品往往只是整個中藥的一部分成分，或只是用某個活性篩選體系導向分離得到的成分，對該靶標沒有活性的成分在分離過程中隨時棄去，因而漏篩的可能性很大；301、覆蓋中藥中的所有成分，分離過程中不隨意丟棄任何成分；2、每個餾分中含有的成分大大簡化；3、微量組分將得到有效的富集 ;4、每個樣品均有標簽，詳細記錄分離過程及指紋圖譜特征； TCM分離餾分樣品庫根據(jù)中藥的臨床應用傳統(tǒng)經(jīng)驗，結合現(xiàn)代醫(yī)學理

23、念選擇多靶標活性篩選 信息反饋 進行高通量多靶標 篩選找出活性餾分發(fā)現(xiàn)一系列具有不同作用的活性餾分（可能還包括毒副作用）中藥產(chǎn)品療效確切，市場前景看好； 治療作用具有適應多樣性，作用靶點/機理及作用物質(zhì)不清； 沒有知識產(chǎn)權保護； 基源植物來源清晰； 31中藥分離餾分樣品庫的試點建設工作已經(jīng)開始啟動國家中醫(yī)藥局2004年投資250萬元開始啟動100種中藥分離餾分樣品庫的建設工作。深圳中心作為主要承擔單位。姚新生院士作為首席科學家負責此項工作；采集任務已經(jīng)全部順利完成，迄今中心已經(jīng)完成30余種中藥分離餾分樣品庫的制備工作，獲得了近18，000余種分離餾分樣品；活性篩選工作開始啟動，并已經(jīng)收到了一定

24、效果32選派有野外采集經(jīng)驗的植物分類學家去現(xiàn)場采集（例：四川地區(qū)藥材采集情況）道地藥材產(chǎn)區(qū)與GAP基地青藏高原野生品種33每種藥材的基源植物用數(shù)碼相機從不同角度拍攝其特征34樣品標示藥材編號ZhangHao2004-015藥材名稱TV拼音Xuecha藥材別名或地方名夏惹植物名雪茶拉丁學名Thamnolia vermicularia英文名無藥用部位全草GAP基地否野生/栽培野生加工方法曬干留樣（庫存）建議置通風干燥處。樣品來源采集課題負責人張浩采集者張浩、陳雛、俞森、賈琳、劉芳、劉顯福采集單位四川大學華西藥學院生藥教研室定名者張浩采集地點四川省康定縣榆林鄉(xiāng)老榆林村雅家埂采集方位海拔：4032.4

25、m；緯度：2954.846N；經(jīng)度：10200.410E采集時間植物：2004年7月3日；藥材：2004年7月3日數(shù)碼照片編號ZhangHao2004-015-14送樣時間2004年8月16日送樣量蠟葉標本：4份；照片：4張；藥材干品：622克送樣人張浩驗收復核人林瑞超、錢忠直、胡士林、蔡少青收樣人王乃利用 途藥典記載無民間習用原葉體：肺熱咳嗽、肺結核、口干舌燥、倦怠無力、眼花頭昏、神經(jīng)衰弱參考文獻藏藥本草備 注主要含有酚酸類，甾醇類，氨基酸，糖類等化學成分詳細記錄基源植物的有關資料35TV（350g,含水量為11.78%）總浸膏YTV(21.9g)用乙醇，水，甲醇，氯仿混懸，并逐漸加入放于研

26、缽的60g硅藻土，拌勻，制粒（20目），烘干。裝沙氏提取器中，分別用氯仿、乙酸乙酯、95%乙醇回流提取10，15，15個小時，各提取物減壓回收溶劑后，60下減壓烘干，稱重；殘渣最后置燒瓶中分別加入1500ml,1000ml,1500ml水回流提取3次，每次2小時，冷卻后棉花過濾，再抽濾至澄清狀，減壓回收溶劑后，60下減壓烘干，稱重氯仿提取物 YTV-C （13.8g） 乙酸乙酯提取物 YTV-A （1.9g） 乙醇提取物 YTV-E （8.7g） 水提取物 YTV-W (5.2g）采集的樣品進行有序分離，給與編號并記錄指紋圖譜特征將藥材剪為約1cm的小段，加入3500ml60%乙醇浸泡過液，加

27、熱回流3小時，再分別用3500ml 60%乙醇回流提取2次，每次3小時，合并提取液，棉花過濾，60下減壓回收至粘膏狀36 YTV-C (13.8g)硅膠中低壓柱快速層析(110g，4x28cm)保留體積: V0=250ml洗脫溶劑：環(huán)己烷乙酸乙酯（1：0；9：1；8：2，7：3；6：4；5：5；0：1）最后甲醇沖柱 每個梯度洗2個保留體積環(huán)己烷9：18：27：36：45：5乙酸乙酯 YTV-C-1 69mgYTV-C-44000mgYTV-C-52300mgYTV-C-2 YTV-C-3 74mg 1042mgYTV-C-6 YTV-C-7 256 mg 149mgYTV-C-8 YTV-C-

28、9 150mg 340mgYTV-C-10 324mgYTV-C-111396mg甲醇37展開劑:環(huán)己烷-乙酸乙酯(7:3)顯色劑:香草醛-濃硫酸, 105,加熱10min 總 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11展開劑:氯仿-甲醇-水-(8:2:0.2)顯色劑:香草醛-濃硫酸， 105,加熱10min總 4 5 6 7 8 9 10 11展開劑:氯仿-甲醇-水-醋酸 (9:1:0.1:0.05)顯色劑:香草醛-濃硫酸, 105,加熱10min11 10 9 8 7 6 5 4 3 總YTV-C111薄層層析結果樣 品:YTV-C-111,用氯仿/甲醇溶解，分別配成 10mg/ml的

29、溶液薄層板:硅膠G預制板(青島海洋)點樣量:23l38YTV-C-4 (3.5g)硅膠中低壓柱快速層析(25g,218cm)保留體積 V0=60ml洗脫溶劑：氯仿-甲醇（1：0；9：1；8：2；0：1）每個梯度洗2個保留體積氯仿9：1甲醇8：2YTV-C-4-1 YTV-C-4-2 410mg 377mgYTV-C-4-3 YTV-C-4-4 109mg 1160mgYTV-C-4-5 YTV-C-4-6 15mg 30mg39YTV-C-4-16薄層層析結果樣 品:YTV-C-4-16,用氯仿/甲醇溶解，分別配成 10mg/ml的溶液薄層板:硅膠G預制板(青島海洋)點樣量:23l展開劑:氯仿

30、-甲醇(9:1)顯色劑:香草醛-濃硫酸/105,加熱10min總 1 2 3 4 5 6展開劑:氯仿-甲醇(8:2)顯色劑:香草醛-濃硫酸, 105,加熱10min總 1 2 3 4 5 640YTV-C-5 (1.8g)硅膠中低壓柱快速層析(15g,119cm)保留體積: V0=40ml洗脫溶劑：氯仿-甲醇（1：0；9：1；8：2；7：3；0：1）每個梯度洗2個保留體積YTV-C-5-1 YTV-C-5-2 145mg 179mgYTV-C-5-3 YTV-C-5-4 69mg 619mgYTV-C-5-5 YTV-C-5-6 154mg 98mgYTV-C-5-7 YTV-C-5-8 10

31、9mg 16mgYTV-C-5-9 17mg 氯仿9：18：27: 3甲醇41YTV-C-5-19薄層層析結果樣 品:YTV-C-5-19,用氯仿/甲醇溶解，分別配成 10mg/ml的溶液薄層板:硅膠G預制板(青島海洋)點樣量:23l展開劑:氯仿-甲醇-水-醋酸 (9:1:0.1:0.05)顯色劑:香草醛-濃硫酸, 105,加熱10min展開劑:氯仿-甲醇-水-(8:2:0.2)顯色劑:香草醛-濃硫酸, 105,加熱10min總 1 2 3 4 5 6 7 8 9總 1 2 3 4 5 6 7 8 942 YTV-A （1.3g)硅膠中低壓柱快速層析(15g,1.5x21cm)保留體積：V0=

32、40ml洗脫溶劑：氯仿甲醇 (1：0；9：1；8：2；7：3；0：1) 每個梯度各洗2個保留體積氯仿9：18：27：3甲醇YTV-A-2 YTV-A-3 460mg 178mgYTV-A-1 181mgYTV-A-4 320mgYTV-A-5 145mgYTV-A-6 20mg43YTV-A-16薄層層析結果樣 品:YTV-A-110,用氯仿/甲醇溶解，分別配成 10mg/ml的溶液薄層板:硅膠G預制板(青島海洋)點樣量:23l展開劑:氯仿-甲醇(8:2)顯色劑:10%硫酸, 105,加熱10min展開劑:氯仿-甲醇(8:2)顯色劑:香草醛-濃硫酸 105,加熱10min展開劑:氯仿-甲醇(8

33、:2)顯色劑:碘熏, 105,加熱10min總 1 2 3 4 5 6總 1 2 3 4 5 6總 1 2 3 4 5 644上清液(B2)Diaion HP20 CC/eluted with Water-EtOHwater30%EtOH70%EtOh50%EtOh50%EtOHB21B22(-)B23(-)B24(-)B25(22g, 7.8g/ml )B26(35g, 15.6g/ml) B27(15g, 62.5g/ml) 95%EtOHZSG Total extract(300g)Suspd. in the water; Extd.with EtOAC 、n-BuOH, success

34、ively;,Evapd. to remove the solvent in Vacuo;EtOAC ext.(18g)(A)BuOH ext.(110g)(B) 甲醇溶解沉淀(B1)2nd step3rd step1st stepODS CC（/water-MeOHB253(1.16g,31.2 g/ml)B254(1.89g,15.6 g/ml)B255(6.2g, 7.8g/ml )50%MeOH40%MeOH50%MeOH4th stepB253B254B255分離的樣品送出去進行高通量活性篩選，注意收集反饋信息45B253B253-7B253-6B253-5B253-2B253-1B253（抗癌活性餾分）PHPLC C18 column, 40%甲醇-水RID