蜈蚣多糖對(duì)Hela細(xì)胞的增殖抑制作用研究

1、蜈蚣多糖對(duì)Hela細(xì)胞的增殖按捺作用研究李興暖韓雅莉余衛(wèi)國(guó)【摘要】目的研究蜈蚣多糖對(duì)人宮頸癌細(xì)胞Hela細(xì)胞的按捺作用及作用機(jī)制。要領(lǐng)用TT法檢測(cè)蜈蚣多糖對(duì)Hela細(xì)胞生長(zhǎng)的按捺作用；流式細(xì)胞儀和AnnexinV-FIT/PI雙熒光染色別離檢測(cè)蜈蚣多糖對(duì)Hela細(xì)胞周期及凋亡環(huán)境的影響。結(jié)果在必然濃度范疇內(nèi)蜈蚣多糖可明顯按捺Hela細(xì)胞的增殖，改變Hela細(xì)胞的細(xì)胞周期，使細(xì)胞停滯于G2/期，并能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。結(jié)論蜈蚣多糖大概通過(guò)改變Hela細(xì)胞的細(xì)胞周期，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，從而對(duì)Hela細(xì)胞的增殖有必然的按捺作用?！娟P(guān)鍵詞】蜈蚣多糖；細(xì)胞周期；細(xì)胞凋亡Keyrds:PlysaharidefrSl

2、pendrasubspinipesutilans;ellyle;ellapptsis少棘蜈蚣SlpendrasubspinipesutilansL.Kh別名百足,屬節(jié)肢動(dòng)物門(mén)，多足綱，唇足目，螟蚣科動(dòng)物，為?中國(guó)藥典?紀(jì)錄的正品藥材，為我國(guó)傳統(tǒng)的鎮(zhèn)痙、通絡(luò)類(lèi)藥物。故國(guó)醫(yī)學(xué)紀(jì)錄和臨床理論均已證實(shí)其具有平靜熄風(fēng)、通絡(luò)止痛、解毒散結(jié)等藥用成果1。當(dāng)代藥理實(shí)行也證實(shí)白蜈蚣具有抗腫瘤和抗動(dòng)脈粥樣硬化等作用2,3，臨床用于治療腫瘤以及心腦血管病等癥。傳統(tǒng)中藥均以整蟲(chóng)入藥，但蜈蚣體內(nèi)身分龐大，且有用身分尚不明白，無(wú)法對(duì)其藥理作用做進(jìn)一步研究。為了探究蜈蚣抗腫瘤作用，本文以少棘蜈蚣為質(zhì)料，對(duì)其體內(nèi)多糖舉行了分

3、散純化，并進(jìn)一步對(duì)其舉行了Hela細(xì)胞增殖的作用的研究，為進(jìn)一步探究蜈蚣抑瘤作用機(jī)制奠基基矗1質(zhì)料1.1質(zhì)料少棘蜈蚣SlpendrasubspinipesutilansL.Kh購(gòu)自汕頭市恒青藥店，由廣東產(chǎn)業(yè)大門(mén)生藥研究室對(duì)其舉行種類(lèi)斷定。人宮頸癌Hela細(xì)胞，由汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院分子病理實(shí)行室提供，微血管內(nèi)皮細(xì)胞VE，由汕頭大學(xué)多學(xué)科研究中央提供。1.2試劑與儀器DEAE-52為hantan公司產(chǎn)物；1640造就基、胰卵白酶、噻唑蘭TT、碘化丙啶PI均購(gòu)自Siga公司；AnnexinV-FIT/PI凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京寶賽生物技能；新生牛血清購(gòu)自杭州四序青生物。TherLabsystes酶標(biāo)儀T

4、her公司；ShelLab二氧化碳造就箱；EpisXL流式細(xì)胞儀Bakanulter公司；倒置顯微鏡、熒光顯微鏡lypus公司；Niknlpix4500數(shù)碼相機(jī)。2要領(lǐng)2.1蜈蚣多糖(plysaharidesfrSlpendrasubspinipesutilansL.Kh,SSP)的制備少棘蜈蚣87g研缽磨碎，參加1000l蒸餾水90恒溫水浴攪拌4h，過(guò)濾，殘?jiān)鼌⒓?00l蒸餾水，重復(fù)上述步調(diào)，過(guò)濾，歸并濾液，濃縮濾液。取上清液，加5倍體積95乙醇4靜置留宿，離心，去上清液，沉淀用少許蒸餾水溶解。Sevag法去卵白數(shù)次4，將去卵白溶液透析枯燥，過(guò)DEAE-52離子互換纖維素色譜柱，以0.05，

5、0.1，0.2，0.4和1lL-1Nal舉行階段洗脫，共得到3個(gè)糖峰，此中濃度0.05lL-1的Nal洗脫峰糖含量最高，網(wǎng)絡(luò)此組分透析枯燥，待用。2.2Hela和人微血管內(nèi)皮細(xì)胞(Huanirvasularendthelialell,VE)的造就取對(duì)數(shù)生恒久的Hela和VE細(xì)胞接種于含10小牛血清的1640造就基中，接種濃度為5105個(gè)/l，置37，52濃度，飽和濕度的二氧化碳造就箱中造就24h。去原造就基，參加含有SSP濃度別離為0，0.5，1，1.5，2，4g/l的維持液含1.5小牛血清的1640造就基，置造就箱中繼承造就24h和48h后舉行實(shí)行。2.3蜈蚣多糖SSP對(duì)Hela細(xì)胞增殖的影

6、響取對(duì)數(shù)生恒久Hela細(xì)胞按上述要領(lǐng)接種于96孔板中，貼壁造就24h，去原造就基，參加含有0.5，1，1.5，2，4g/lSSP維持液，總體積為200l，別離造就24，48h后取出，每孔參加TT20l繼承孵育4h，吸去上清，參加200l二甲基亞砜，振蕩15in，酶標(biāo)儀檢測(cè)570n波長(zhǎng)下各孔吸光值A(chǔ)，按以下公式盤(pán)算細(xì)胞增殖按捺率。細(xì)胞增殖的按捺率%1實(shí)行組A值/比較組A值100取VE細(xì)胞作為正常細(xì)胞比較，實(shí)行要領(lǐng)同上。2.4蜈蚣多糖SSP對(duì)Hela細(xì)胞周期的影響取對(duì)數(shù)生恒久Hela細(xì)胞，接種到50l造就瓶中，按上述要領(lǐng)造就，貼壁造就24h后取出，參加含有SSP濃度別離為0.5，1，1.5g/l維

7、持液中，造就24，48h后通例消化網(wǎng)絡(luò)細(xì)胞，用PBS洗濯3次，參加70預(yù)冷乙醇4結(jié)實(shí)留宿，離心去乙醇，用PBS洗濯兩次，RNaseA50g/l37消化30in，PI染色后上機(jī)檢測(cè)細(xì)胞周期變革5。2.5蜈蚣多糖對(duì)SSPHela細(xì)胞凋亡的影響將蓋玻片切成4塊，參加12孔板中，取100l5104個(gè)/l的細(xì)胞懸液加到玻片上，4h后待細(xì)胞貼壁后再參加900l造就基，繼承貼壁造就20h。去掉原造就液，用PBS洗濯3次后，參加含0.5，1，1.5g/lSSP維持液，24h后，將玻片取出放入AnnexinV-FIT/PI染液中染色15in，熒光顯微鏡下不雅察并照相6。2.6統(tǒng)計(jì)學(xué)要領(lǐng)實(shí)行所得數(shù)據(jù)均表現(xiàn)s的情勢(shì)

8、,數(shù)據(jù)用SPSS11.0軟件統(tǒng)計(jì)，差異濃度處置懲罰組之間舉行t查驗(yàn)，當(dāng)P0.05為差異明顯，P0.01為差異極明顯。3結(jié)果3.1蜈蚣多糖SSP對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的影響見(jiàn)表12。實(shí)行結(jié)果表白，在必然劑量范疇內(nèi)SSP對(duì)Hela細(xì)胞增殖有按捺作用。由表1所示，作用24h時(shí)，0.5，1，1.5和2g/lSSP對(duì)Hela細(xì)胞增殖有顯著按捺作用；而SSP為4g/l時(shí)，對(duì)Hela細(xì)胞增殖有促進(jìn)作用；作用48h時(shí)，0.5，1和1.5g/lSSP對(duì)Hela細(xì)胞增殖有必然按捺作用，2和4g/lSSP對(duì)Hela細(xì)胞有促進(jìn)作用。表白SSP在24h內(nèi)對(duì)Hela細(xì)胞按捺作用較強(qiáng)，且在低劑量下按捺作用顯著。表1SSP對(duì)Hela

9、細(xì)胞的影響略表2為同樣條件下SSP對(duì)正常細(xì)胞VE增殖的影響。作用24h時(shí)，0.5，1，1.5g/lSSP對(duì)VE細(xì)胞增殖按捺作用不顯著；作用48h，各劑量SSP對(duì)VE細(xì)胞均具有促進(jìn)增殖作用。說(shuō)明SSP對(duì)腫瘤細(xì)胞的按捺作用較正常細(xì)胞顯著。表2SSP對(duì)VE細(xì)胞的影響略3.2蜈蚣多糖SSP對(duì)Hela細(xì)胞周期的影響流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果表現(xiàn)，作用24h時(shí)，各劑量SSP組G2/期細(xì)胞所占比例均顯著多于比較組，但各劑量SSP處置懲罰48h時(shí)各時(shí)相細(xì)胞所占比率與比較組比力差異不明顯。說(shuō)明在24h范疇內(nèi)SSP對(duì)Hela細(xì)胞作用明顯。表3SSP對(duì)Hela細(xì)胞周期的影響略3.3蜈蚣多糖SSP對(duì)Hela細(xì)胞凋亡的影響細(xì)胞

10、凋亡早期細(xì)胞膜上產(chǎn)生PS磷脂酰絲氨酸外翻，標(biāo)識(shí)表記標(biāo)幟了FIT的AnnexinV能與PS外翻的細(xì)胞結(jié)合產(chǎn)生綠色熒光，PI可以透過(guò)凋亡晚期細(xì)胞或殞命細(xì)胞的細(xì)胞膜，使其細(xì)胞核染成赤色。實(shí)行結(jié)果見(jiàn)圖1，空缺比較組僅有少量細(xì)胞著綠色熒光，說(shuō)明PS外翻很少，細(xì)胞沒(méi)有出現(xiàn)凋亡的特性。而3個(gè)SSP處置懲罰組均有較多細(xì)胞著綠色熒光和少量細(xì)胞著赤色熒光，說(shuō)明細(xì)胞PS外翻嚴(yán)峻，均產(chǎn)生了必然程度的細(xì)胞凋亡和殞命。4討論已有資料報(bào)道蜈蚣油性提取物可以或許按捺肝癌細(xì)胞的增殖7，蜈蚣含有類(lèi)組胺物質(zhì)的構(gòu)造提取物對(duì)胃癌、肝癌細(xì)胞有按捺作用8，而對(duì)SSP組分按捺腫瘤的研究如今尚未見(jiàn)有報(bào)道。細(xì)胞增殖實(shí)行結(jié)果表現(xiàn)，SSP對(duì)Hela

11、細(xì)胞增殖有顯著按捺作用。為進(jìn)一步分析SSP按捺Hela細(xì)胞增殖的機(jī)制，我們從細(xì)胞周期角度深化研究。由流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果表現(xiàn)，SSP可使G0/G1和S期細(xì)胞淘汰，而G2/期細(xì)胞增多，提示SSP可改變Hela細(xì)胞增殖生長(zhǎng)周期，使細(xì)胞停滯于G2/期，按捺細(xì)胞周期歷程。凋亡是細(xì)胞固有的自動(dòng)滅亡歷程，在維持構(gòu)造穩(wěn)態(tài)中起著極緊張的作用，細(xì)胞凋亡受阻是導(dǎo)致腫瘤發(fā)病和耐藥的重要病理學(xué)底子之一，腫瘤細(xì)胞周期的改變通常和細(xì)胞的凋亡有關(guān)，AnnexinV-FIT/PI雙熒光染色檢測(cè)結(jié)果表現(xiàn)SSP可使Hela細(xì)胞的凋亡增長(zhǎng)，表現(xiàn)了SSP誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用。TT法檢測(cè)細(xì)胞增殖和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期均表現(xiàn)SSP對(duì)H

12、ela細(xì)胞的影響，在藥物處置懲罰24h較48h結(jié)果顯著，說(shuō)明SSP對(duì)Hela細(xì)胞的有用作用時(shí)間短；SSP對(duì)Hela細(xì)胞的按捺作用濃度僅在必然范疇內(nèi)其作用1.5g/l擺布，濃度過(guò)高會(huì)促進(jìn)細(xì)胞增殖，其機(jī)理如今尚不明晰，有待于進(jìn)一步實(shí)行證實(shí)?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】1王賢純.蜈蚣的藥用研究希望J.動(dòng)物學(xué)雜志,2002,37(3):88.2周永芹,韓莉.中藥蜈蚣的研究希望J.中藥材,2022,31(2):315.3張艷慧,司秋菊,王鑫國(guó).蜈蚣抗家兔動(dòng)脈粥樣硬化的實(shí)行研究J.中藥藥理與臨床，2022，21(1):26.4董英,張艷芳,孫艷輝.水飛薊粗多糖脫卵白要領(lǐng)的比力J.食品科學(xué),2022,28(12):82.5BenP,ytetry.Ahighthrughputapprahte