PCR實(shí)驗(yàn)室說明資料講解

1、PCR實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)PCR實(shí)驗(yàn)室分為四個區(qū)域，進(jìn)入各工作區(qū)域必需嚴(yán)格依照單一方向進(jìn)行，不同的工作區(qū)域使用不同的作服（工作人員離開各工作區(qū)域時，不得將工作服帶出，四區(qū)域訣別1： 試劑配制區(qū)n 2. 樣本處理區(qū)n 3. 核酸擴(kuò)增區(qū)n 4. 產(chǎn)物分析區(qū)n 如使用全自動分析儀，區(qū)域可適當(dāng)合并且三四區(qū)可合并且為擴(kuò)增產(chǎn)物分析。各區(qū)的功能是試劑準(zhǔn)備區(qū)：擴(kuò)增試劑的配制、分裝和保存1.1.2樣本處理區(qū)：樣本登記分裝核酸提取保存和加樣1.1.3擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)擴(kuò)增產(chǎn)物的測定結(jié)果分析、登記及報(bào)告1.2擴(kuò)增前區(qū)與擴(kuò)增后區(qū)應(yīng)嚴(yán)格分開，須使用不同的房間，兩區(qū)之間最好有一的間隔1.3使商品化試劑盒可在樣本處理區(qū)進(jìn)行少量試劑配.4

2、在滿足下列操作和清潔處理要求的前提下樣本處理區(qū)和試劑準(zhǔn)備區(qū)可設(shè)在同一房間.1在生物安全柜內(nèi)操作1.4.2每個實(shí)驗(yàn)人員、實(shí)驗(yàn)組訣別使用各自的試劑及耗.4.3盛放污染材料的器皿密封并且一次性使用1.4.4用有效的方法關(guān)于操作區(qū)域和共享器具在實(shí)驗(yàn)前后進(jìn)行清潔及消毒。設(shè)計(jì)要求：實(shí)驗(yàn)室可以是分散形式，也可以是組合形現(xiàn)要主要是以組合形式為主流。完成一PCR 實(shí)驗(yàn)，通常應(yīng)經(jīng)過試劑配制還應(yīng)增加樣本粉碎進(jìn)程。一、分散形式實(shí)驗(yàn)室 所謂分散形式實(shí)驗(yàn)室，是指完成上述實(shí)驗(yàn)進(jìn)程的實(shí)驗(yàn)用房彼此相距較遠(yuǎn)，呈分散部署形式。關(guān)于于這種部署形式實(shí)驗(yàn)室，由于各個實(shí)驗(yàn)之間不易相互干擾，因此無需特殊條件要求。二、組合形式實(shí)驗(yàn)室 所謂組合

3、形式實(shí)驗(yàn)室, 是指完成四個實(shí)驗(yàn)進(jìn)程的實(shí)驗(yàn)用房相鄰部署，組成獨(dú)力實(shí)驗(yàn)區(qū)域的形式。關(guān)于于組合形實(shí)驗(yàn)室，由于各個實(shí)驗(yàn)間集中部署，容易造成相互干擾，因此，關(guān)于總體布局以及屏障系統(tǒng)具有一定的要求。各室在入口處設(shè)緩沖 以減少室內(nèi)外空氣交換。試劑配制室及樣本處理室宜呈微正壓，以防外界含核酸氣溶膠的空氣進(jìn)入，造成, 控制進(jìn)風(fēng)風(fēng)量大于排風(fēng)風(fēng)量達(dá)到正壓效果。核酸擴(kuò)增室及產(chǎn)物分析室應(yīng)呈微負(fù)壓，以防含核酸的氣溶膠擴(kuò)散出去污染試劑與樣本，可以 控制排風(fēng)風(fēng)量大于進(jìn)風(fēng)風(fēng)量達(dá)到負(fù)壓效果。在理想情況下，實(shí)驗(yàn)室緩沖間內(nèi)，可設(shè)置正壓，使室內(nèi)空氣不流向室外，室外空氣不流向內(nèi)。室實(shí)驗(yàn)室進(jìn)風(fēng)由原有中央空調(diào)控制好后 處。如果使用熒光PCR

4、儀，擴(kuò)增室和產(chǎn)物分析室可以合并且。若房間進(jìn)深允許，可設(shè)內(nèi)部專用走廊。需要指出的是在減少室內(nèi)外空氣交換方面，緩沖間比專用走廊更有意義。各個區(qū)域之間應(yīng)具備單向的實(shí)驗(yàn)工藝流、物流、人流與氣流，形成單流程的保護(hù)屏障，避免實(shí)驗(yàn)之間的相互干擾，防止核酸氣溶膠關(guān)于實(shí)驗(yàn)進(jìn)程造成污染產(chǎn)生假性 果。 實(shí)驗(yàn)室的墻體，囊括頂棚，應(yīng)結(jié)構(gòu)牢固、氣密性好；一切陰角宜采用圓弧形線條過渡； 光潔、不吸附、耐侵蝕、易清洗消毒；地面材料應(yīng)滿足無縫隙、無滲漏、光潔、耐腐 的要求。如果使用熒光PCR儀，擴(kuò)增室和產(chǎn)物分析室可以合并且。若房間進(jìn)深允許，可設(shè)內(nèi)部專用走廊。需要指出的是在減少室內(nèi)外空氣交換方面，緩沖間比專用走廊更有意義。各個區(qū)

5、域之間應(yīng)具備單向的實(shí)驗(yàn)工藝流、物流、人流與氣流，形成單流程的保護(hù)屏障，避免實(shí)驗(yàn)之間的相互干擾，防止核酸氣溶膠關(guān)于實(shí)驗(yàn)進(jìn)程造成污染產(chǎn)生假性 果。 實(shí)驗(yàn)室的墻體，囊括頂棚，應(yīng)結(jié)構(gòu)牢固、氣密性好；一切陰角宜采用圓弧形線條過渡； 光潔、不吸附、耐侵蝕、易清洗消毒；地面材料應(yīng)滿足無縫隙、無滲漏、光潔、耐腐 的要求。主要設(shè)備試劑準(zhǔn)備區(qū)儀器設(shè)備主要有冰箱、超凈臺、加樣器、混勻器、天平和離心機(jī)等，加器、天平除了要專用，還應(yīng)有定期校準(zhǔn)。試劑分裝應(yīng)在超凈臺中進(jìn)行擴(kuò)增反映混合液應(yīng)使用分子生物學(xué)級的，試劑制備好后應(yīng)有質(zhì)檢：一是否有污染、二是檢測試劑的擴(kuò)增效果。標(biāo)本制備區(qū) 儀器設(shè)備主要有生物安全柜、加樣器、離心機(jī)、溫育

6、儀、混勻器等擴(kuò)增區(qū) 擴(kuò)增區(qū)的主要儀器是核酸擴(kuò)增儀、超凈臺、微量加樣器、離心機(jī)、可移動紫外燈。擴(kuò)儀需進(jìn)校準(zhǔn)。并且配備電源，以防止由于電壓的波動，停電關(guān)于擴(kuò)增效果的影響。分析區(qū) 本區(qū)所使用的儀器設(shè)備有酶標(biāo)儀、洗板機(jī)、加樣器和水浴箱等潔凈實(shí)驗(yàn)區(qū)的緩沖間部分面積不能超過主實(shí)驗(yàn)室的八分之,一這是有規(guī)則的.、 主體結(jié)構(gòu)： 主體為彩鋼板、鋁合金型材。室內(nèi)一切陰角、陽角均采用鋁合0內(nèi)圓角鋁， 從而解決容易污染、積塵、不易清掃等問題。結(jié)構(gòu)牢固，線條簡明，美觀大方，密封性好。、 標(biāo)準(zhǔn)的四區(qū)分隔和氣壓調(diào)節(jié)：將 進(jìn)程分成試劑準(zhǔn)備、標(biāo)本制備和擴(kuò)增，產(chǎn)物分析四個獨(dú)力的實(shí)驗(yàn)區(qū)。整個區(qū)域有一個整體緩沖走廊。每個獨(dú)力實(shí)驗(yàn)區(qū)設(shè)置

7、有緩沖區(qū)，同時各 經(jīng)過氣壓調(diào)節(jié)，使整個實(shí)驗(yàn)進(jìn)程中試劑和標(biāo)本免受氣溶膠的污染并且降低擴(kuò)增產(chǎn)物關(guān)于人員和環(huán)境的污染。 可打開緩沖區(qū)，緩沖區(qū)和 PCR 擴(kuò)增區(qū)的排風(fēng)扇往外排氣，在實(shí)驗(yàn)區(qū)的外墻上和各扇門上都安裝有風(fēng)量可調(diào)的回風(fēng)口，空氣經(jīng)過回風(fēng)口向室內(nèi)換3實(shí)驗(yàn)區(qū)和三個緩沖區(qū)頂部以及傳送窗內(nèi)部安裝有紫外燈，供消毒用區(qū) 還設(shè)置移動紫外線燈，關(guān)于實(shí)驗(yàn)桌進(jìn)行局部消毒。、 不銹鋼傳遞窗： 試劑和標(biāo)本經(jīng)過機(jī)械連鎖不銹鋼（不建議使用電子連鎖方式）傳遞窗傳遞，保證試劑和標(biāo)本在傳遞進(jìn)程中不受污 （人物分流5 、 地面 地面建議使用卷材地面或自流坪地面耐侵蝕。6、 照明 燈具要選用凈化燈具，能達(dá)到便于清洗、不積塵的特點(diǎn)。在

8、建設(shè)的進(jìn)程中應(yīng)注意： 規(guī)矩的安裝流程和全面的服務(wù)流程。嚴(yán)格依照規(guī)矩科學(xué)設(shè)計(jì)的安裝流程。安裝前需要確定以下安裝條件，如：電源電壓，電源進(jìn)線位置，電話網(wǎng)絡(luò)線進(jìn)線位置，進(jìn)水水壓，最小安 空間，地面平整度，通風(fēng)孔、進(jìn)水管和下水管的位置等，理想狀態(tài)的空間尺三、工作區(qū)域及設(shè)備要求（一） 試劑儲存和準(zhǔn)備區(qū) 2-8C 和-15C冰箱 （1-1000ul） 、移動紫外燈（近工作臺面、消耗品：一次性手套、一次性吸水紙、耐高壓處理的離心管和加樣器吸頭（帶濾心、專用工作服和工作鞋、專用辦公用品（二） 標(biāo)本制備區(qū) 2-8C 冰箱、-20C 或-80C冰箱 、高速臺式冷凍離心機(jī)、混允器 、水浴箱或加熱模塊、微量加樣器（覆

9、蓋1-1000ul） 、可移動紫外燈（近工作臺面、生物安全柜 、消耗品：一次性手（帶濾心） 、專用工作服和工作鞋、專用辦公用品如需處理大分子NA（三） 擴(kuò)增反映混合物配制和擴(kuò)增區(qū) 、 核酸擴(kuò)增儀 （覆蓋1-1000ul） （近工作臺面）4、消耗品：一次性手套、一次性吸水紙、耐高壓處理的離心管和加樣器吸頭（、 專用 工作服和工作鞋 、 專用辦公用品 四擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)視試驗(yàn)方法不同而定。基本儀器設(shè)備如下： 、 微量加樣器（1-1000ul） 、 可移動紫外燈（近工作臺面、 消耗品：一次性手套、一次性吸水紙、加樣器吸頭（帶濾心、 專用工作服和工作鞋、 專用辦公用 品 人員和樣本的安全是由生物安全柜和

10、定向氣流共通來保證CR 實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)規(guī)程中規(guī)則人員和樣本必需單向流動。即從試劑準(zhǔn)備區(qū)到樣本制備區(qū)，再從樣本制備走向擴(kuò)增區(qū)和產(chǎn)物分析區(qū)”，絕關(guān)于不能反向流動，以辟免交叉污染。氣流方向只規(guī)則試劑準(zhǔn)備區(qū)為微正壓或常壓， 區(qū)為常壓或負(fù)壓，擴(kuò)增區(qū)和產(chǎn)物分析區(qū)為負(fù)壓，壓力梯度是從試劑準(zhǔn)備到產(chǎn)物分析是高到低的。規(guī)程并且沒有規(guī)則要做成全新風(fēng)系統(tǒng)，但是為降低交叉污染的風(fēng)險，建議做成全 風(fēng)系統(tǒng)。1 概述 臨床基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)又稱PCR 實(shí)驗(yàn)，是專門用來試驗(yàn)艾滋病染性疾病的一種檢測手段。它可以經(jīng)過將病毒體內(nèi)所含的基因進(jìn)行擴(kuò)增的方法，測出一些病 含量不高的感染者體內(nèi)是否含有特定的病毒。由于該檢測方法可以測出普通試驗(yàn)難以檢測

11、出 病毒并且具有靈敏度高、特異性高、快捷、關(guān)于樣本要求低等優(yōu)點(diǎn)，因此被臨床醫(yī)生廣為認(rèn)可， 廣泛應(yīng)用于醫(yī)院的臨床診斷和各防疫檢測部門的禽疫病診斷。但是，這種實(shí)驗(yàn)需要有能保證 關(guān)于安全、配置合理的實(shí)驗(yàn)室和非常規(guī)矩的操作為前提。近年來關(guān)于臨床基因擴(kuò)增試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室的 設(shè)越來越得到重視，因?yàn)樗P(guān)于檢測結(jié)果的可靠性、準(zhǔn)確性和安全性起到至關(guān)重要的作用。本 主要從臨床基因擴(kuò)增試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室的平面布局，空調(diào)通風(fēng)系統(tǒng)設(shè)計(jì)、氣流控制和污染的防制幾 方面關(guān)于 實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)中的主要特點(diǎn)進(jìn)行了闡述。臨床基因擴(kuò)增試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)的核心問題是如何避免污染。因此，實(shí)驗(yàn)室的平面布局、空調(diào)通風(fēng)系統(tǒng)設(shè)計(jì)、氣流控制等都是圍繞這個核心 題進(jìn)行的。

12、下面就關(guān)于這幾個方面訣別進(jìn)說明。2 PCR實(shí)驗(yàn)室平面布局臨床基因擴(kuò)增試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室原則上分為四個單獨(dú)的工作區(qū)域：試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)、標(biāo)本制備區(qū)、擴(kuò)增反映混合物配制 擴(kuò)增區(qū)、擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)。為避免交叉污染，進(jìn)入各個工作區(qū)域必需嚴(yán)格遵循單一方向進(jìn) 即只能從試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)標(biāo)本制備區(qū)擴(kuò)增反映混合物配制和擴(kuò)增區(qū)各實(shí)驗(yàn)區(qū)之間的試劑及樣本傳遞應(yīng)經(jīng)過傳遞窗進(jìn)行PCR 實(shí)驗(yàn)室平面部署示意圖如圖1 所示。圖 1PCR實(shí)驗(yàn)室平面部署示意圖3 實(shí)驗(yàn)室空調(diào)通風(fēng)系統(tǒng)設(shè)計(jì)及壓力控制PCR 實(shí)驗(yàn)室并且沒有嚴(yán)格的凈化要求，但是為避免各個實(shí)驗(yàn)區(qū)域間交叉污染的可能性，宜采用全送全排的氣流組織 式。同時，要嚴(yán)格控制送、排風(fēng)的比例以保證各

13、實(shí)驗(yàn)區(qū)的壓力要求.1 試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)該實(shí)驗(yàn)區(qū)主要進(jìn)行的操作為貯存試劑的制備、試劑的分裝和主反映混合液的制備。試劑和用于 本制作的材料應(yīng)直接運(yùn)送至該區(qū)，不得經(jīng)過其他區(qū)域。試劑原材料必需貯存在本區(qū)內(nèi)，并且在 區(qū)內(nèi)制備成所需的貯存試劑。關(guān)于與氣流壓力的控制，本區(qū)并且沒有嚴(yán)格的要求3.2 標(biāo)本制備區(qū)該區(qū)域主要進(jìn)行的操作為臨床標(biāo)本的保存、核、提取、貯存及其加入至擴(kuò)增反映管和測定RNAcNA 的合成。 本區(qū)的壓力梯度要求為：相關(guān)于于鄰近區(qū)域?yàn)檎龎?，以避免從鄰近區(qū)進(jìn)入本區(qū)的氣溶膠污染。另外，由于在加樣操作中可能會發(fā)生氣溶膠所致的污染，所 應(yīng)避免在本區(qū)內(nèi)不必要的走動。3.3 擴(kuò)增反映混合物配制和擴(kuò)增區(qū)該區(qū)域

14、主要進(jìn)行的操作為NAcNA擴(kuò)增。此外，已制備的NA模板和合成的的加入和主反映混合液來自試劑貯存和制備區(qū)制備成反映混合液等也可在本區(qū)內(nèi)進(jìn)行PCR測定中， 通常在第一輪擴(kuò)增后必需打開反映管，因此巢式擴(kuò)增有較高的污染危險性，第二次加樣必需 本區(qū)內(nèi)進(jìn)行。 本區(qū)的壓力梯度要求為：相關(guān)于于鄰近區(qū)域?yàn)樨?fù)壓，以避免氣溶膠從本區(qū)漏出。避免氣溶膠所的污染，應(yīng)盡快減少在本區(qū)內(nèi)的不必要的走動。各別操作如加樣等應(yīng)在超凈內(nèi)進(jìn)行。 3.4 擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)該區(qū)域主要進(jìn)行的操作為擴(kuò)增片段的測定。如使用全自動封閉析儀器檢測，此區(qū)域可不設(shè)。區(qū)是最主要的擴(kuò)增產(chǎn)物污染來源，因此關(guān)于本區(qū)的壓力梯度的求為：相關(guān)于于鄰近區(qū)域?yàn)樨?fù)壓，以避免擴(kuò)

15、增產(chǎn)物從本區(qū)擴(kuò)散至其它區(qū)域。污染的預(yù)防與控制PCR實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)的核心問題是如何避免污染。在實(shí)際工作中，常見的有以下幾種污染類型： 增產(chǎn)的污染；天然基因組NA 的污染；試劑的污染以及標(biāo)本間的污染。由于一旦發(fā)生污實(shí)驗(yàn)就必需停滯，直到找到污染源為止，而且實(shí)驗(yàn)結(jié)果必需作廢，需重新進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。所以發(fā) 污染后再圍繞實(shí)驗(yàn)室來尋找污染源不但耗時而且繁瑣，浪費(fèi)人力物力。因此要避免污染，首 應(yīng)是預(yù)防，而不是排除。4.1 工作區(qū)域的嚴(yán)格劃分（1）各個實(shí)驗(yàn)區(qū)域設(shè)置合理；（2）各個實(shí)驗(yàn)區(qū)域要有鮮明的標(biāo)記（如醒目的門牌或不同的地面顏色以避免各個不同實(shí)驗(yàn)區(qū)域設(shè)備物品、試劑等發(fā)生混淆。4.2 合理的系統(tǒng)設(shè)置（1）合理的空調(diào)通風(fēng)系

16、統(tǒng)設(shè)置，盡快采用全送全排的空調(diào)系統(tǒng)；（2）嚴(yán)格的氣流壓力控制，保證不同的實(shí)驗(yàn)區(qū)內(nèi)不同的壓力要求4.3 規(guī)范的操作 （1）臨床基因擴(kuò)增試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室的技術(shù)人員必需進(jìn)行上崗培訓(xùn)，經(jīng)培訓(xùn)合格后才能從事臨床基因擴(kuò)增試驗(yàn)的工作；在實(shí)驗(yàn)操作進(jìn)程中，操作者必需戴手套，并且經(jīng)常更換。此外，操作中使用一次性帽子也是一個有效地防止污染的措施（）清潔工作即時、正確。實(shí) 驗(yàn)工作結(jié)束后，必需立即關(guān)于本區(qū)進(jìn)行清潔。除常規(guī)的消毒液體關(guān)于表面進(jìn)行擦拭消毒或紫外線 的照射消毒外，關(guān)于一些實(shí)驗(yàn)設(shè)備還應(yīng)進(jìn)行高壓消毒處理4.4 嚴(yán)格的管理 （1）嚴(yán)格控制進(jìn)出實(shí)驗(yàn)室的人員。與實(shí)驗(yàn)無關(guān)的人員不得隨意進(jìn)出實(shí)驗(yàn)室，有條件的情況下要設(shè)置獨(dú)力的通道

17、 進(jìn)出整個實(shí)驗(yàn)區(qū)的門； （2）在各個實(shí)驗(yàn)區(qū)域使用帶有鮮明區(qū)別標(biāo)志的工作服（如不同顏當(dāng)工作人員離開時不得將本區(qū)的工作服帶至其它區(qū)域（）盡快減少在實(shí)驗(yàn)區(qū)內(nèi)不必要的走動以減少交叉污染的可能性。（4）擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)是最主要的擴(kuò)增產(chǎn)物污染來源，廢液不能在實(shí)驗(yàn)室中傾倒，必需經(jīng)消毒液浸泡消毒后在遠(yuǎn)離實(shí)驗(yàn)室的地方棄掉，用過的吸頭等一次性料也應(yīng)經(jīng)消毒液浸泡消毒后統(tǒng)一處理，如焚燒等（）擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)可能會用到某些可致基因突變和有毒物質(zhì)，應(yīng)特別注意實(shí)驗(yàn)人員的安全防護(hù)4.5 完備的實(shí)驗(yàn)室配套設(shè)施完備的實(shí)驗(yàn)室配套設(shè)施是保證實(shí)驗(yàn)工作的必要條件，應(yīng)根據(jù)各個實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)內(nèi)容的不同配備相應(yīng)的設(shè) 和儀器，如超凈工作臺、離心機(jī)、加樣

18、器等。PCR實(shí)驗(yàn)室并且沒有嚴(yán)格的凈化要求，但是為避免各個實(shí)驗(yàn)區(qū)域間交叉污染的可能性，宜采用送全的氣流組織形式3.1 試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)該實(shí)驗(yàn)區(qū)主要進(jìn)行的操作為貯存試劑的制備、試劑的分裝和主反映混合液的制備。試劑和用于標(biāo)本制作的材料應(yīng)直接運(yùn)送至該區(qū)，不得經(jīng)過其他區(qū)域。試劑原材料必需貯 在3.2 標(biāo)本制備區(qū) 該區(qū)域主要進(jìn)行的操作為臨床標(biāo)本的保存、核、提取、貯存及其加入至擴(kuò)增反映管和測定RNA 時cNA 的合成。 本區(qū)的壓力梯度要求為：相關(guān)于于鄰近區(qū)域?yàn)檎龎海员苊鈴泥徑鼌^(qū)進(jìn)入本區(qū)的氣溶膠污染。另外，由于在加樣操作中可能會發(fā)生氣溶膠 致的污染，所以應(yīng)避免在本區(qū)內(nèi)不必要的走動3.3 擴(kuò)增反映混合物配制和擴(kuò)增區(qū)該區(qū)域主要進(jìn)行的操作為NAcNA NA模板和合成的來自樣本制備區(qū)) 的來自試劑貯存和制備區(qū)制備成反映混合液等也可在本區(qū)內(nèi)進(jìn)行PCR測定中，通常在第一輪擴(kuò)增后必需打開反映管，因此巢式擴(kuò)增有較高的污染危險性，第次加必需在本區(qū)內(nèi)進(jìn)行。本區(qū)的壓力梯度要求為：相關(guān)于于鄰近區(qū)域?yàn)?/p>