分離分析法導(dǎo)論IntroductiontoChromatography

1、分離分析法導(dǎo)論IntroductiontoChromatography色譜法概述色譜法(Chromatography)溯源100多年前俄國(guó)植物學(xué)家Tswett(茨維特)分離植物色素時(shí)采用的實(shí)驗(yàn)方法他將植物色素的石油醚提取液倒入裝有碳酸鈣的直立玻璃管,再加入石油醚使其自由流下,結(jié)果色素中各組份互相分離形成各種不同顏色的譜帶Tswett用希臘語(yǔ)chroma(色)和graphos(譜)描述他的實(shí)驗(yàn)方法，即現(xiàn)在的Chromatography(色譜法)分離分析法導(dǎo)論IntroductiontoChromatographyTswett色素分離實(shí)驗(yàn)A 一根長(zhǎng)玻璃管填充碳酸鈣的顆粒B 將碾碎之植物葉片的提取液

2、灌入柱中C 隨著石油醚提取液向下流過(guò)柱子，現(xiàn)出展寬的色帶A B C分離分析法導(dǎo)論IntroductiontoChromatography 1952年馬丁 (Arcger Martin，1910) 英國(guó)人辛格 (Richard Synge，1914) 英國(guó)人，發(fā)明分配色譜法 1938年R庫(kù)恩 (Riehard Kuhn，19001967) 德國(guó)人，利用Tswett 的方法研究類胡蘿卜素和維生素 色譜法與諾貝爾獎(jiǎng)的關(guān)系 分離分析法導(dǎo)論IntroductiontoChromatography年代獲獎(jiǎng)學(xué)科獲獎(jiǎng)研究工作1937化學(xué)類胡蘿卜素化學(xué)，維生素A和B1938化學(xué)類胡蘿卜素化學(xué)1939化學(xué)聚甲烯和

3、高萜烯化學(xué)1950生理學(xué)、醫(yī)學(xué)性激素化學(xué)及其分離、腎皮素化學(xué)及其分離1951化學(xué)超鈾元素的發(fā)現(xiàn)1955化學(xué)腦下腺激素的研究和第一次合成聚肽激素1958化學(xué)胰島素的結(jié)構(gòu)1961化學(xué)光合作用時(shí)發(fā)生的化學(xué)反應(yīng)的確認(rèn)1970生理學(xué)、醫(yī)學(xué)關(guān)于神經(jīng)元觸處遷移物質(zhì)的研究1970化學(xué)糖核苷酸的發(fā)現(xiàn)及其在生物合成碳水化合物中的作用1972化學(xué)核糖核酸化學(xué)酶結(jié)構(gòu)的研究1972生理學(xué)、醫(yī)學(xué)抗體結(jié)構(gòu)的研究色譜法與諾貝爾獎(jiǎng)的關(guān)系 分離分析法導(dǎo)論IntroductiontoChromatography效率高。上百種性質(zhì)類似的化合物可在同一色譜柱上得到分離，復(fù)雜樣品分析。速度快。幾分鐘至幾十分鐘完成復(fù)雜樣品的分析。 靈敏度

4、高。直接檢測(cè)納克級(jí)，預(yù)濃縮可達(dá)皮克級(jí)。用量少。一次分析只需數(shù)納升至數(shù)微升的溶液樣品。選擇性好。選擇分離模式和檢測(cè)方法，只分析感興趣的部分。 同時(shí)分析。短時(shí)間內(nèi)可以實(shí)現(xiàn)幾十種成分的同時(shí)分離與定量。 易于自動(dòng)化。從進(jìn)樣到數(shù)據(jù)處理的全自動(dòng)化操作。定性能力較差。已經(jīng)發(fā)展色譜法與其他分析技術(shù)聯(lián)用。 色譜法特點(diǎn) 分離分析法導(dǎo)論IntroductiontoChromatography色譜法的原理 是利用混合物中各組份在不同的兩相中溶解,分配,吸附等化學(xué)作用性能的差異,當(dāng)兩相作相對(duì)運(yùn)動(dòng)時(shí),使各組分在兩相中反復(fù)多次受到上述各作用力而達(dá)到相互分離 兩相中有一相是固定的,叫作固定相(Stationary Phase

5、),有一相是流動(dòng)的,稱為流動(dòng)相(Mobile Phase),流動(dòng)相又叫洗脫劑,溶劑 相(Phase): 物理化學(xué)術(shù)語(yǔ),特指在某一系統(tǒng)中,具有相同成分及相同物理、化學(xué)性質(zhì)的均勻物質(zhì)部分。各相之間有明顯可分的界面色譜法原理分離分析法導(dǎo)論IntroductiontoChromatography色譜法的分類（1）按流動(dòng)相的物態(tài)分: 氣相色譜(Gas Chromatography, GC) 用氣體作為流動(dòng)相(又叫載氣) 液相色譜(Liquid Chromatography, LC) 用液體作為流動(dòng)相(又叫洗脫劑) 按操作形式分: 平面色譜 紙色譜 薄層色譜 柱色譜分離分析法導(dǎo)論Introductiont

6、oChromatography色譜法的分類（2）按分離原理分類: 吸附色譜(Absorption Chromatography)根據(jù)樣品組分對(duì)活性固定相表面吸附親和力的不同實(shí)現(xiàn)分離 分配色譜(Partition Chromatography)分離基于樣品組分在固定相和流動(dòng)相中的溶解度(分配系數(shù))不同 離子交換色譜(Ion ExchangeChromatography)根據(jù)樣品組份離子交換親和力的差異分離,簡(jiǎn)稱離子色譜(IC) 體積排除色譜(Size Exclusion Chromatography) GPC(Gel PermeationChromatography) 固定相是疏水性凝膠,流動(dòng)相

7、是有機(jī)溶劑 GFC(Gel Filtration Chromatography) 固定相是親水性凝膠,流動(dòng)相是水溶液分離分析法導(dǎo)論IntroductiontoChromatography色譜圖及色譜常用術(shù)語(yǔ)色譜圖(Chromatogram):色譜柱流出物通過(guò)檢測(cè)器時(shí)所產(chǎn)生的響應(yīng)信號(hào)對(duì)時(shí)間的曲線圖,其縱坐標(biāo)為信號(hào)強(qiáng)度,橫坐標(biāo)為時(shí)間峰高色譜峰時(shí)間對(duì)羥基苯甲酸甲酯；2. 對(duì)羥基苯甲酸乙酯；3. 對(duì)羥基苯甲酸丙酯； 4. 對(duì)羥基苯甲酸丁酯 1234分離分析法導(dǎo)論IntroductiontoChromatography基線、色譜峰、峰高基線是在正常實(shí)驗(yàn)操作條件下，沒(méi)有組分流出，僅有流動(dòng)相通過(guò)檢測(cè)器時(shí)，檢

8、測(cè)器所產(chǎn)生的響應(yīng)值。穩(wěn)定的基線是一條直線，若基線下斜或上斜，稱為漂移，基線的上下波動(dòng)，稱為噪音。漂移噪音分離分析法導(dǎo)論IntroductiontoChromatography色譜峰的面積峰面積分離分析法導(dǎo)論IntroductiontoChromatography色譜峰的寬度色譜峰的寬度分離分析法導(dǎo)論IntroductiontoChromatography死時(shí)間t0：不被固定相滯留的組分，從進(jìn)樣到出峰最大所需的時(shí)間。保留時(shí)間tR：組分從進(jìn)樣到出峰最大之所需的時(shí)間。死體積V0：不被固定相滯留的組分，從進(jìn)樣到出峰最大之所需的流動(dòng)相的體積。保留體積VR：組分從進(jìn)樣到出峰最大之所需的流動(dòng)相的體積。調(diào)整保

9、留時(shí)間tR tR=tR-t0調(diào)整保留體積VR VR=VR-V0VR=tRF F-流動(dòng)相流動(dòng)速度 （-1)色譜保留值分離分析法導(dǎo)論IntroductiontoChromatography相對(duì)保留值在相同的操作條件下，一組分相對(duì)另一組分的調(diào)整保留值之比相對(duì)保留值相對(duì)保留值僅與柱溫、固定相性質(zhì)有關(guān)，在同一類色譜柱上具有比較好的重現(xiàn)性，是較好的定性指標(biāo)。分離分析法導(dǎo)論IntroductiontoChromatography相對(duì)保留值計(jì)算分離分析法導(dǎo)論IntroductiontoChromatography分配平衡在分配色譜中，組分的色譜行為與其在固定相與流動(dòng)相之間的分配行為密切相關(guān)組分在兩相之間達(dá)到分

10、配平衡時(shí)，該組分在兩相中的濃度之比是一個(gè)常數(shù)，這一常數(shù)稱為分配系數(shù)，用K 表示。分離分析法導(dǎo)論IntroductiontoChromatography保留時(shí)間與分配系數(shù)的關(guān)系分離分析法導(dǎo)論IntroductiontoChromatography分配比組分在兩相中物質(zhì)的量之比稱為分配比:不能被固定相保留的組分k=0分離分析法導(dǎo)論IntroductiontoChromatography分配比與保留值的關(guān)系由于分配過(guò)程發(fā)生在固定相與流動(dòng)相之間，故分配比可用保留時(shí)間或保留體積來(lái)表示：分配比k又稱為容量因子、容量比或分配容量分離分析法導(dǎo)論IntroductiontoChromatography塔板理論

11、1941年馬丁（Martin）和欣革（Synge）最早提出塔板理論，將色譜柱比作蒸餾塔，把一根連續(xù)的色譜柱設(shè)想成由許多小段組成。在每一小段內(nèi)，一部分空間為固定相占據(jù)，另一部分空間充滿流動(dòng)相。組分隨流動(dòng)相進(jìn)入色譜柱后，就在兩相間進(jìn)行分配。并假定在每一小段內(nèi)組分可以很快地在兩相中達(dá)到分配平衡，這樣一個(gè)小段稱作一個(gè)理論塔板，一個(gè)理論塔板的長(zhǎng)度稱為理論塔板高度H。 經(jīng)過(guò)多次分配平衡，分配系數(shù)小的組分，先離開蒸餾塔，分配系數(shù)大的組分后離開蒸餾塔。由于色譜柱內(nèi)的塔板數(shù)相當(dāng)多，因此即使組分分配系數(shù)只有微小差異，仍然可以獲得好的分離效果。分離分析法導(dǎo)論IntroductiontoChromatography塔

12、板數(shù)的計(jì)算塔板理論只考慮了熱力學(xué)因素，沒(méi)有考慮動(dòng)力學(xué)因素，應(yīng)用受到較大局限。n 塔板數(shù) Y 色譜峰寬度 L 色譜柱長(zhǎng)度 H塔板高度分離分析法導(dǎo)論IntroductiontoChromatography速率理論-Van Deemter方程速率理論是荷蘭學(xué)者范弟姆特于1956年提出的, 表述了影響柱效的因素及提高柱效的多種途徑，其核心是速率方程（也稱范弟姆特方程式）。H = A + B/u + cuH：理論塔板高度；u：載氣的線速度(cm/s)A渦流擴(kuò)散項(xiàng) B/u分子擴(kuò)散項(xiàng)c u傳質(zhì)阻力項(xiàng)分離分析法導(dǎo)論IntroductiontoChromatographyH = A + B/u + cu A渦流

13、擴(kuò)散項(xiàng)A = 2dpdp：固定相的平均顆粒直徑；：固定相的填充不均勻因子。討論：固定相顆粒越小dp，填充的越均勻，A，H，柱效n。表現(xiàn)在渦流擴(kuò)散所引起的色譜峰變寬現(xiàn)象減輕，色譜峰較窄?？招拿?xì)管柱A=0分離分析法導(dǎo)論IntroductiontoChromatographyH = A + B/u + cu B/u分子擴(kuò)散項(xiàng) D為組分在流動(dòng)相中的擴(kuò)散系數(shù)，單位是cm2s-1。彎曲因子，填充柱色譜 1，空心毛細(xì)管柱則 為1.分離分析法導(dǎo)論IntroductiontoChromatographyH = A + B/u + cu c u傳質(zhì)阻力項(xiàng) C包括流動(dòng)相傳質(zhì)阻力系數(shù)Cm和固定相傳質(zhì)阻力系數(shù)CsCm

14、為組分從流動(dòng)相移向固定相時(shí)所受到阻力：Cs組分從固定相移向流動(dòng)相時(shí)所受到阻力：分離分析法導(dǎo)論IntroductiontoChromatography速率理論的討論 將渦流擴(kuò)散項(xiàng)、分子擴(kuò)散項(xiàng)及傳質(zhì)阻力項(xiàng)分別代入Van Deemter方程，得到渦流擴(kuò)散、分子擴(kuò)散及傳質(zhì)阻力是造成色譜峰擴(kuò)展柱效下降的主要原因。 通過(guò)選擇適當(dāng)?shù)墓潭ㄏ嗔６取⑤d氣種類、液膜厚度及載氣流速可提高柱效。 速率理論為色譜分離和操作條件的選擇提供了理論指導(dǎo)。闡明了流速和柱溫對(duì)柱效及分離的影響。 各種因素相互制約，如載氣流速增大，分子擴(kuò)散項(xiàng)的影響減小，使柱效提高，但同時(shí)傳質(zhì)阻力項(xiàng)的影響增大，又使柱效下降；柱溫升高，有利于傳質(zhì)，但又加

15、劇了分子擴(kuò)散的影響，選擇最佳條件，才能使柱效達(dá)到最高。 分離分析法導(dǎo)論IntroductiontoChromatography柱效與流速的關(guān)系載氣流速低時(shí)： 分子擴(kuò)散項(xiàng)成為影響柱效的主要因素，隨著流速的增加，柱效提高。載氣流速高時(shí)： 傳質(zhì)阻力項(xiàng)是影響柱效的主要因素，隨著流速的提高，柱效下降。對(duì)于氣相色譜而言分離分析法導(dǎo)論IntroductiontoChromatography氣相色譜的最佳流速將H = A + B/u + cu 微分，得在一定的色譜條件下測(cè)得三種不同流速下對(duì)應(yīng)的H值，其中的A、B、C 組成一個(gè)三元一次方程組，進(jìn)而求出A、B、C值，算出H最小和u最佳分離分析法導(dǎo)論Introduc

16、tiontoChromatography色譜分離效能的衡量分離度分離度是評(píng)價(jià)一張色譜圖以及決定如何解決、開發(fā)和優(yōu)化分離方法的依據(jù)分離分析法導(dǎo)論IntroductiontoChromatography分離度與柱效能、選擇性的關(guān)系分離度方程 n 柱效（塔板數(shù)） 2,1 相對(duì)保留值，反映固定相對(duì)兩組分的選擇性 k 容量因子（分配比）分離分析法導(dǎo)論IntroductiontoChromatography 柱效較高， 2,1較大,完全分離； , 2,1不是很大，柱效較高，峰較窄，基本上完全分離； 柱效較低， 2,1較大,但分離的不好； 2,1小，柱效低，分離效果更差。分離度當(dāng)R大于時(shí)，兩峰分離的比例達(dá)到

17、99.7%，兩種組分完全分離。分離分析法導(dǎo)論IntroductiontoChromatography原始分離狀況分離度與柱效能、選擇性的關(guān)系改變n改變2,1 改變k分離分析法導(dǎo)論IntroductiontoChromatography分離分析法導(dǎo)論IntroductiontoChromatography色譜定性方法 與標(biāo)樣對(duì)照利用保留值及相對(duì)保留值定性：通過(guò)對(duì)比試樣中具有與純物質(zhì)相同保留值的色譜峰，來(lái)確定試樣中是否含有該物質(zhì)及在色譜圖中的位置。但該方法不適用于在不同儀器上獲得的數(shù)據(jù)之間的對(duì)比。 利用加入法定性：將純物質(zhì)加入到試樣中，觀察各組分色譜峰的相對(duì)變化。 分離分析法導(dǎo)論Introduct

18、iontoChromatography色譜定性方法分離分析法導(dǎo)論IntroductiontoChromatography 利用保留指數(shù)法定性色譜定性方法保留指數(shù)又稱Kovats指數(shù)（），是一種重現(xiàn)性較好的定性參數(shù)。測(cè)定方法：將正構(gòu)烷烴作為標(biāo)準(zhǔn)，規(guī)定其保留指數(shù)為分子中碳原子個(gè)數(shù)乘以100（如正己烷的保留指數(shù)為600）。其它物質(zhì)的保留指數(shù)（IX）是通過(guò)選定兩個(gè)相鄰的正構(gòu)烷烴，其分別具有Z和Z1個(gè)碳原子。被測(cè)物質(zhì)X的調(diào)整保留時(shí)間應(yīng)在相鄰兩個(gè)正構(gòu)烷 烴的調(diào)整保留值之間如圖所示： 分離分析法導(dǎo)論IntroductiontoChromatography與其他分析儀器聯(lián)用的定性方法(結(jié)構(gòu)鑒定) 色譜的分離功

19、能強(qiáng)大，但定性能力不足，并不能完全確證各個(gè)組分，特別是新化合物，故將色譜與其他分析儀器聯(lián)用來(lái)獲得化合物結(jié)構(gòu)信息，但聯(lián)用通常涉及較復(fù)雜的裝置，價(jià)格昂貴。 1. 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀； 2. 氣相色譜-紅外光譜聯(lián)用儀； 3. 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀；4. 液相色譜-核磁共振波譜儀 色譜定性方法分離分析法導(dǎo)論IntroductiontoChromatography分離分析法導(dǎo)論IntroductiontoChromatography色譜定量分析試樣中各組分質(zhì)量與其色譜峰面積成正比，即： mi=fi Ai比例系數(shù)fi 稱為絕對(duì)校正因子，單位面積對(duì)應(yīng)的物質(zhì)的量： fi=mi/Ai在實(shí)際工作中，較多使用相對(duì)校正因子 fi ，即組分的絕對(duì)校正因子與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的絕對(duì)校正因子之比。校正因子和相對(duì)校正因子分離分析法導(dǎo)論IntroductiontoChromatography定量方法：歸一化法當(dāng)試樣中所有組分全部出峰,組分?jǐn)?shù)與色譜峰數(shù)相符時(shí),可以采用該法。計(jì)算