體內藥分的設計與評價課件

1、第三章 體內藥物分析方法的建立與確證 藥物分析教研室 設計依據(jù) 建立的一般步驟 驗證的內容與要求DistributionMetabolismAbsorptionExcretion第一節(jié) 分析方法的設計依據(jù) 體內藥物分析方法的選擇，一般根據(jù)藥物的結構、理化性質、體內藥物濃度大小、干擾成分的多少，樣品的預處理方法、試驗條件和目的等因素綜合考慮，方可選擇出供生物樣品中藥物及其代謝物含量測定的分析方法。1. 測定藥時曲線 藥-時曲線 C-T (Concentration-Time curve) 以時間為橫坐標，藥物的一些特征數(shù)量（如體內藥量、血藥濃度、尿藥排泄速度、累積尿藥量等）為縱坐標繪制的曲線（一

2、）明確分析方法設計的目的要求生物等效性(Bioequivalence)：一種藥物的不同制劑在相同的試驗條件下，給以相同的劑量，反映其吸收速率和程度的主要動力學參數(shù)沒有明顯的統(tǒng)計學差異。（一）明確分析方法設計的目的要求 “首選色譜法，如HPLC、GC以及GC-MS、LC-MS、LC-MS/MS聯(lián)用技術。一般采用內標法定量，必要時采用生物學方法或生物化學方法。” 中國藥典2010版檢測寬線性范圍(CmaxCmax的1/20)方法不必強調方法的簡便、快速（一）明確分析方法設計的目的要求要求同時測定原形藥物和代謝產物檢測寬線性范圍高靈敏度(ng、pg級) 高專屬性(原形藥物及其代謝產物的分離) 原形藥

3、物和活性代謝物同時存在可能對測定濃度的準確性產生影響（一）明確分析方法設計的目的要求例：環(huán)孢霉素A監(jiān)測測定結果熒光偏振免疫法比高效液相色譜法約高30%，臨床調整劑量時，必須參照各自的有效血藥濃度標準進行（一）明確分析方法設計的目的要求3. 臨床藥物監(jiān)測 TDM (Therapeutic Drug Monitoring)單劑量給藥后的時-效曲線 方法盡量簡便、易行；適用于長期、批量樣品測定 大多采用UV、RIA或EIA等（二）調研文獻了解待測藥物的特性 已報道藥物的測定，應綜覽文獻，掌握已解決和尚在的問題，同時獲得待測藥物的詳細理化特性及其在體內的代謝情況。 文獻報道方法只可借鑒，不可生搬硬套！

4、無文獻報道的新藥品，根據(jù)新藥的化學結構，理化特性，在體內存在的狀態(tài)及代謝情況，參考同類型藥物的文獻資料，設計全新的方法。2. 體內存在狀態(tài)及其代謝情況（二）調研文獻了解待測藥物的特性與血漿蛋白結合的強弱及結合率的高低分離萃取方法 蛋白結合較強不宜直接采用溶劑萃取體內濃度高低、代謝過程及其代謝產物濃度較低（尤其有代謝產物共存）代謝產物的干擾與特定代謝產物的同時測定采用LC-MS、EIA等分析檢測技術 （三）儀器設備與實驗室條件 根據(jù)實驗室現(xiàn)有的儀器設備和可能獲得的裝備加以考慮，然后考慮有可能在其它實驗室使用的儀器裝備，合理選擇可行的分析方法。（一）檢測條件的篩選 取一定量待測物或代謝物純品，按所

5、擬定的分析方法進行體外測定，求得待測藥物濃度與儀器響應值之間的關系；濃度線性范圍；最佳檢測濃度；儀器檢測的靈敏度及測定的最佳條件。HPLC 調整檢測器(類型、條件) 色譜柱(型號、牌號、填料性狀與粒徑、柱長度) 流動相(組分及其配比)及其流速 柱溫、進樣量、內標物質的濃度及其加入量等 使各物質具有足夠的方法靈敏度(LOQ) 良好的色譜參數(shù)(n、R、T) 適當?shù)谋Ａ魰r間(tR)（一）檢測條件的篩選（二）分離條件的篩選1.以水代替空白樣品添加標準品測定水標準品溶液樣品前處理考察 提取回收率、LOD、萃取溶劑、溶液pH值、揮發(fā)濃縮等條件。2. 以處理過的空白樣品進行測定要求在待測藥物、代謝物、內標物

6、的“信號窗”無內源性物質信號。 空白不干擾樣品的測定?。ǘ┓蛛x條件的篩選3.以空白樣品添加標準品測定考察線性范圍、精密度、準確度、靈敏度、回收率、特異性等指標。加入標準溶液加入空白生物基質渦旋混勻4.體內實際樣品的測定（二）分離條件的篩選 已確定的分析方法及其條件不能完全確認是否適合于實際生物樣品的測定 確立分析方法后，尚需進行實際生物樣品的測試藥物在體內可能與內源性物質結合(如血漿蛋白結合物)或代謝生成數(shù)個代謝產物及其進一步的結合物(或綴合物)考察代謝產物對藥物、內標物的干擾情況 進一步驗證方法的可行性第三節(jié) 分析方法驗證的內容與要求 Accuracy Precision Specific

7、ity Sensitivity Reproducibility Recovery Matrix Effect Quality control Stability Calibration Curve & Range藥物制劑人體生物利用度和生物等效性試驗指導原則 中國藥典二部化學藥物臨床藥代動力學研究技術指導原則 【H】GCL1-2化學藥物制劑人體生物利用度和生物等效性研究技術指導原則 【H】GCL2-1（一）特異性(Specificity) 空白血漿丹參酮A加入空白血漿健康受試者服藥2h后血漿樣品丹參酮A丹參酮A內標（一）特異性(Specificity) 左旋多巴內源性物質左旋多巴甲酯（二）標準

8、曲線和定量范圍（Calibration Curve & Range）C=0.0020.2ug/mlC=0.210.0ug/ml 必須用至少6個濃度建立標準曲線(n = / 5); 應使用與待測樣品相同的生物介質; 定量范圍要能覆蓋全部待測濃度; 不允許將定量范圍外推求算未知樣品的濃度。 建立標準曲線時應隨行空白生物樣品，但計算時不包括該點。 （二）標準曲線和定量范圍（Calibration Curve & Range）（三）定量下限（Lower Limit of quantitation，LLOQ） 定量下限是標準曲線上的最低濃度點，表示測定樣品中符合準確度和精密度要求的最低藥物濃度。 LLO

9、Q應能滿足測定35個消除半衰期時樣品中的藥物濃度或能檢測出Cmax的1/101/20的藥物濃度。其準確度應在真實濃度的80%120%范圍內，相對標準差(RSD)應小于20%。至少應由5個標準樣品測試結果證明。（四）準確度和精密度（Accuracy & Precision） 一般要求選擇高、中、低3個濃度的質控樣品同時進行方法的精密度和準確度考察。低濃度通常選擇在LLOQ的3倍以內；高濃度接近于標準曲線的上限；中間選一個濃度。在測定批內精密度時，每一濃度至少制備并測定5個樣品。為獲得批間精密度，應在不同天連續(xù)制備并測定，至少有連續(xù)3個分析批（不少于45個樣品）的結果合格。（四）準確度和精密度（A

10、ccuracy & Precision）1.00 n=5 10.0 +血漿 n=5 50.0 n=5同一天Inter-Day1次/日;連測5天Intra-Day3*5=15分析批同一批連續(xù)三批Inter-BatchIntra-Batch（五）穩(wěn)定性（Stability）標準溶液短期室溫長期低溫(-4 ,-20 )生物樣品短期室溫長期低溫(-20 ,-70 )反復冷凍解凍（六）提取回收率（Extraction Recovery）從生物樣本基質中回收得到分析物質的響應值除以標準品產生的響應值即為分析物的提取回收率。也可以說是將供試生物樣品中分析物提取出來供分析的比例?？疾旄?、中、低3個濃度的提取回

11、收率，其結果應精密并具有可重現(xiàn)性。 考察生物樣品預處理過程造成的藥物損失程度（六）提取回收率（Extraction Recovery）回收率 (%)=A測/A真100%A測：被測藥物標準品加入空白樣品中，按設定方法處理、進樣測定，測得的色譜峰面積A真：純品溶劑溶解并稀釋使其濃度與第一份處理后濃度一致，進樣測得的色譜峰面積 A測=A藥/A內100% A真=A藥/A內100%內標法0.5 ml PlasmaSample 50lIS 50l混勻堿化乙酸乙酯 5 ml渦旋3min3500 rpm 離心 8 min上清液 4 ml氮氣吹干殘渣物MP復溶200 l20 l 上清液 進樣分析（六）提取回收率

12、（Extraction Recovery）0.5 ml PlasmaSample 50lIS 50l混勻1.5 ml MeOH渦旋 1min16000 rpm 離心 8min 20 l 上清液 進樣分析（六）提取回收率（Extraction Recovery）（七）基質效應（Matrix Effect） 基質（matrix） 尚無統(tǒng)一的解釋，曾稱為“一種分析物（analyte）的環(huán)境（milieu）”，即指標本中除分析物以外的一切組成。 以血清膽固醇（Chol）測定而言，就是指Chol以外血清中的一切成分及其物理、化學性質。（七）基質效應（Matrix Effect）直流電壓（DC） 射頻電壓

13、RF（七）基質效應（Matrix Effect）電噴霧源(ESI)（七）基質效應（Matrix Effect）大氣壓化學電離源(APCI) （八）方法學質控 每個分析批生物樣品測定時應建立新的標準曲線，并隨行測定高、中、低三個濃度的質控樣品。每個濃度至少雙樣本，并應均勻分布在未知樣品測試順序中。 當一個分析批中未知樣品數(shù)目較多時，應增加各濃度質控樣品數(shù)，使質控樣品數(shù)大于未知樣品總數(shù)的5%。 質控樣品測定結果的偏差一般應小于15%，低濃度點偏差一般應小于20%。最多允許1/3的質控樣品結果超限，但不能出現(xiàn)在同一濃度質控樣品中。 如質控樣品測定結果不符合上述要求，則該分析批樣品測試結果作廢。 應用

14、示例LC-MS/MS法研究氨金黃敏顆粒中對乙酰氨基酚、鹽酸金剛烷胺和馬來酸氯苯那敏 精密吸取血漿樣品0.5mL,置10 mL玻璃離心管中,精密加入內標溶液100L (500gL-1) ,渦旋混勻30 s后,加乙酸乙酯5mL,渦旋混勻3 min, 1750g離心5 min,分取上清液4 mL, 40 水浴中以氮氣吹干,殘留物用200L流動相渦旋溶解, 16800 g離心5min,取上清液20L進行LC-MS/MS分析,按內標標準曲線法計算血漿樣品中對乙酰氨基酚、鹽酸金剛烷胺及馬來酸氯苯那敏的濃度。1. 血漿樣品處理方法應用示例2. 專屬性應用示例3. 線性范圍及定量下限 對乙酰氨基酚血漿樣品標準

15、曲線濃度(C)分別為8, 16, 32, 80, 160, 320,800, 1 600, 3 200和8 000gL - 1 ;鹽酸金剛烷胺血漿樣品標準曲線濃度(C)分別為0. 8, 1. 6, 3. 2, 8. 0,16. 0, 32. 0, 80. 0, 160, 320和800gL - 1 ;馬來酸氯苯那敏血漿樣品標準曲線濃度(C )分別為0. 04,0.08, 0. 16, 0. 40, 0. 80, 1. 60, 4. 00, 8. 00, 16. 0 和40. 0gL - 1 ;以對乙酰氨基酚、鹽酸金剛烷胺和馬來酸氯苯那敏與內標峰面積比(R )定量。應用示例應用示例4. 回收率取空白血漿分別加對乙酰氨基酚、鹽酸金剛烷胺和馬來酸氯苯那敏對照品溶液適量使成濃度分別為16, 32.0 和3 200 gL - 1 , 1.6,32.0和320gL - 1 , 0. 08, 1. 60和16. 0gL - 1的低、中、高不同濃度血漿樣本各5份,