轉(zhuǎn)錄組測序課件

1、轉(zhuǎn)錄組的測序技術(shù)方法及當(dāng)前進(jìn)展 一、轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)背景 二、轉(zhuǎn)錄組測序流程 四、轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)應(yīng)用實(shí)例 三、轉(zhuǎn)錄組測序應(yīng)用領(lǐng)域 五、轉(zhuǎn)錄組測序發(fā)展前景 轉(zhuǎn)錄組？ 轉(zhuǎn)錄組是特定組織或細(xì)胞在某一發(fā)育階段或功能狀態(tài)下轉(zhuǎn)錄出來的所有RNA 的集合轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)背景轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)又稱轉(zhuǎn)錄組高通量測序（transcriptome sequencing）或稱為全轉(zhuǎn)錄組鳥槍法測序（Whole Transcriptom Shotgun Sequencing WTSS）把高通量測序技術(shù)應(yīng)用到有mRNA逆轉(zhuǎn)錄生成的cDNA上，從而獲得來自不同基因的mRNA片段在特定樣本中的含量，這就是mRNA片段或mRNA-Seq

2、，同原理，各種類型的轉(zhuǎn)錄本都可以用深度測序技術(shù)進(jìn)行高通量檢測。原則上, 所有的高通量測序技術(shù)都能進(jìn)行RNA測序。自2005年以來, 以Roche 公司的454 技術(shù)、Illumina 公司的Solexa 技術(shù)和ABI 公司的SOLiD 技術(shù)為標(biāo)志的新一代測序技術(shù)相繼誕生, 之后HelicosBiosciences 公司又推出單分子測序(Single molecule sequencing, SMS)技術(shù)。新一代測序又稱作深度測序或高通量測序, 是相對于傳統(tǒng)的Sanger 測序而言,主要特點(diǎn)是測序通量高, 測序時(shí)間和成本顯著下降。各平臺測序原理及序列長度的差異決定了各種高通量測序儀具有不同的應(yīng)用

3、側(cè)重 一、轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)背景 二、轉(zhuǎn)錄組測序流程 四、轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)應(yīng)用實(shí)例 三、轉(zhuǎn)錄組測序應(yīng)用領(lǐng)域 五、轉(zhuǎn)錄組測序發(fā)展前景 一、轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)背景 二、轉(zhuǎn)錄組測序流程 四、轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)應(yīng)用實(shí)例 三、轉(zhuǎn)錄組測序應(yīng)用領(lǐng)域 五、轉(zhuǎn)錄組測序發(fā)展前景轉(zhuǎn)錄組測序應(yīng)用領(lǐng)域應(yīng)用實(shí)例 2009年Surali Azim和 Lao Kaiqin領(lǐng)導(dǎo)的課題組通過對單個(gè)小鼠卵裂球細(xì)胞的RNA- Seq數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，分析發(fā)現(xiàn)至少5個(gè)測序所獲得的reads比微陣列技術(shù)多出75（5270）的表達(dá)基因，并鑒定了1753個(gè)嶄新的剪切位點(diǎn)。除此以外，單細(xì)胞的RNA-seq結(jié)果表明了在相同的卵裂球或卵母細(xì)胞中，至少有8-19的基

4、因存在兩個(gè)以上的轉(zhuǎn)錄異構(gòu)體，該現(xiàn)象清楚表明了在胚胎發(fā)育過程中單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的復(fù)雜性。最后，通過對單個(gè)Dicer1-/- 和 Ago2-/-卵母細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組測序，相對野生型來說，Dicer1-/- 和 Ago2-/-卵母細(xì)胞分別發(fā)現(xiàn)1696和1553個(gè)基因異常上調(diào)，1571和1121個(gè)基因異常下調(diào)，而619基因是相同的。這種單細(xì)胞RNA-Seq技術(shù)檢測將大大提高我們對單個(gè)細(xì)胞在哺乳動物發(fā)育中轉(zhuǎn)錄復(fù)雜性的理解。密歇根大學(xué)的研究人員結(jié)合Roche 454和Illumina Solexa測序平臺對病人細(xì)胞系和腫瘤樣品的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行測序，發(fā)現(xiàn)了前列腺癌中新的基因融合事件。在新發(fā)現(xiàn)的融合中存在一個(gè)周期性的轉(zhuǎn)錄

5、本通讀，稱為SLC45A3-ELK4，以及幾個(gè)個(gè)別病人獨(dú)有的個(gè)體突變?nèi)诤?。而周期性的融合被認(rèn)為是癌癥的主要誘因。該文章發(fā)表在2009年5月的Nature雜志上。2010年12月份美國加州大學(xué)圣克魯茲分校霍華德休斯醫(yī)學(xué)研究院Sofie Salama教授所領(lǐng)導(dǎo)的課題組描述了一種通過轉(zhuǎn)錄組高通量測序方法測定RNA結(jié)構(gòu)的方法(Fragmentation sequencing ，F(xiàn)ragSeq)，該方法發(fā)表在自然方法學(xué)。該方法利用核酸酶P1只切割單鏈RNA的特性對小鼠RNA進(jìn)行片段化，片段化RNA的大小在20100nt之間，然后在片段的5和3端分別加上測序接頭，再進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增，最后構(gòu)建Frag

6、Seq文庫并對其進(jìn)行高通量測序。同時(shí)作者通過生物信息學(xué)分析大量的高通量測序結(jié)果，并輔以實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)成功測定了小鼠的非編碼RNA的二級結(jié)構(gòu)。轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)的發(fā)展前景轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)的優(yōu)勢1）數(shù)字化信號2）高靈敏度3）任意物種的全基因組分析4）更廣泛的解決范圍轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)的劣勢1）數(shù)據(jù)龐大2）轉(zhuǎn)錄組復(fù)雜使得很難追蹤所有基因中罕見RNA亞型和其表達(dá)變化3）單細(xì)胞或少量細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序是一個(gè)亟待解決的問題1、雖然轉(zhuǎn)錄組技術(shù)還面臨著種種困難, 但作為剛剛起步的新技術(shù)轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)已經(jīng)顯示出其他轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)無可比擬的優(yōu)勢：既能提供單堿基分辨率的轉(zhuǎn)錄組注釋又能提供全基因組范圍的“數(shù)字化”的基因表達(dá)譜, 而且其

7、成本通常比芯片和大規(guī)模的Sanger EST 測序要低。3. 轉(zhuǎn)錄組測序的強(qiáng)項(xiàng), 就在于它是個(gè)“開放系統(tǒng)”, 它的發(fā)現(xiàn)能力和尋找新的信息的能力從本質(zhì)上高于芯片技術(shù), 相信隨著相關(guān)學(xué)科的發(fā)展和測序成本的逐步降低,轉(zhuǎn)錄組測序必將在轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究領(lǐng)域占主導(dǎo)地位。4. 轉(zhuǎn)錄組研究能夠從整體水平研究基因功能以及基因結(jié)構(gòu), 揭示特定生物學(xué)過程以及疾病發(fā)生過程中的分子機(jī)理。RNA-Seq 作為 一種新的高效、快捷的轉(zhuǎn)錄組研究手段正在改變著人們對轉(zhuǎn)錄組的認(rèn)識。RNA-Seq 利用高通量測序技術(shù)對組織 或細(xì)胞中所有RNA反轉(zhuǎn)錄而成的cDNA文庫進(jìn)行測序, 通過統(tǒng)計(jì)相關(guān)讀段(reads)數(shù)計(jì)算出不同RNA的表達(dá)量,