動物生物化學(xué)試驗(yàn)二

1、實(shí)驗(yàn)二電泳技術(shù)教學(xué)目的與要求：掌握常用的生物化學(xué)電泳技術(shù)，了解電泳中的注意事項(xiàng)。教學(xué)重點(diǎn)與難點(diǎn)：電泳系統(tǒng)的構(gòu)建及注意事項(xiàng)。教學(xué)方法與手段：講授和學(xué)生動手操作。學(xué)時安排：2學(xué)時教學(xué)內(nèi)容：一、引言生物大分子如蛋白質(zhì)，核酸，多糖等大多都有陽離子和陰離子基團(tuán)，稱為兩 性離子。常以顆粒分散在溶液中，它們的靜電荷取決于介質(zhì)的H+濃度或與其他 大分子的相互作用。在電場中，帶電顆粒向陰極或陽極遷移，遷移的方向取決于 它們帶電的符號，這種遷移現(xiàn)象即所謂電泳。二、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、任?wù)及原理實(shí)驗(yàn)?zāi)康模赫莆针娪炯夹g(shù)方法及注意事項(xiàng)。實(shí)驗(yàn)任務(wù)：學(xué)會醋酸纖維素薄膜電泳的使用方法。實(shí)驗(yàn)原理：醋酸纖維素薄膜電泳（cellulose

2、acetate membrance electrophoresis） 以醋酸纖維薄膜為支持物。醋酸纖維素素薄膜是由二乙酸纖維素加工制成，具有 均一的泡沫結(jié)構(gòu)，厚度僅120um。醋酸纖維素素薄膜作為是電泳支持體有以下優(yōu) 點(diǎn)： 八、 ：電泳后區(qū)帶界限清晰；通電時間較短（二十分鐘至一小時）；它對各種蛋白質(zhì)（包括血清白蛋白，溶菌酶及核糖核酸酶）都幾乎完全不 吸附，因此無拖尾現(xiàn)象；對染料也沒有吸附。作為區(qū)帶電泳的支持物進(jìn)行蛋白電泳有簡便、快速、樣品用量少、應(yīng)用范圍 廣、分離清晰、沒有吸附現(xiàn)象等優(yōu)點(diǎn)。目前已廣泛用于血清蛋白、脂蛋白、血紅 蛋白、糖蛋白和同功酶的分離以及免疫電泳中。例如，以醋酸纖維素薄膜為支

3、持物，正常人血清在pH8.6的緩沖體系中電泳 1h左右，染色后顯示5條區(qū)帶。清蛋白泳動最快，其余依次為a 1，a 2一，P 一,及Y 一球蛋白。這些區(qū)帶經(jīng)洗脫后可用分光光度計(jì)法定量，也可直接進(jìn)行 光吸收掃描自動繪出區(qū)帶吸收峰及相對百分比。臨床醫(yī)學(xué)常利用它們間相對百分 比的改變或異常區(qū)帶的出現(xiàn)作為臨床鑒別診斷的依據(jù)。此法由于操作簡單、快速、 分辨率高及重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)。目前，以成為臨床生化檢驗(yàn)的常規(guī)操作之一。三、實(shí)驗(yàn)的拓展(由本實(shí)驗(yàn)的完成深化和延伸所學(xué)的知識，啟發(fā)學(xué)生利用現(xiàn) 有的設(shè)備拓展出新的實(shí)驗(yàn)內(nèi)容,培養(yǎng)學(xué)生的創(chuàng)新思維和創(chuàng)新能力。)醋酸纖維素薄膜電泳f支持物f紙、瓊脂糖、聚丙烯酰胺凝膠-電泳適用

4、范 圍。四、介紹主要儀器設(shè)備與使用(1)新鮮血清(制備時要無溶血現(xiàn)象)(2)電極緩沖液：巴比妥-巴比妥鈉緩沖液()pH8.6,0.075mol/L,離子強(qiáng) 度0.06)：分別稱取巴比妥1.66g和巴比妥鈉12.76g,合并后用蒸餾水溶解并定 容至 1000ml。(3)染色液：稱取氨基黑10B0.5g,分別加入蒸餾水40ml、甲醇50ml、冰 醋酸10ml,混勻后，貯存于試劑瓶中。(4)漂洗液：分別量取95%乙醇45ml、冰醋酸5ml和蒸餾水50ml,混勻 即可。(5)透明液：甲液：分別取冰醋酸15ml和無水乙醇85ml,將二者混勻即可。乙液：分別取冰醋酸25ml和無水乙醇75ml,將二者混勻即

5、可。(6)0.4mol/LNaOH溶液：稱取16gNaOH,用蒸餾水溶解并定容至1000ml。(7)鑷子(竹夾)，醋酸纖維素薄膜(厚度約為120um),濾紙，鉛筆與直 尺，點(diǎn)樣器或毛細(xì)管，電泳儀與水平電泳槽，分光光度計(jì)。電泳槽是電泳系統(tǒng)的核心部分，根據(jù)電泳的原理，電泳支持物都是放在兩個 緩沖液之間，電場通過電泳支持物連接兩個緩沖液，不同電泳采用不同的電泳槽。電源：要使荷電的生物大分子在電場中泳動，必須加電場，且電泳的分辨率 和電泳速度與電泳時的電參數(shù)密切相關(guān)。不同的電泳技術(shù)需要不同的電壓，電流 和功率范圍，所以選擇電源主要根據(jù)電泳技術(shù)的需要。五、強(qiáng)調(diào)實(shí)驗(yàn)中要注意的問題1、醋酸纖維素薄膜的預(yù)處理

6、市售醋酸纖維素薄膜均為干膜片，薄膜的浸潤與選膜是電泳成敗的重要關(guān)鍵 之一。將干膜片漂浮于電極緩沖液表面，其目的是選擇膜片厚薄及均勻度，如漂 浮15s30s時，膜片吸水不均勻，則有白斑點(diǎn)或條紋，這提示膜片厚薄不勻， 應(yīng)舍去不用，以免造成電泳后區(qū)帶扭曲，界線不清，背景脫色困難，結(jié)果難以重 復(fù)。由于醋酸纖維薄膜親水性比紙小，浸泡30min以上是保證膜片上有一定量的 緩沖液，并使其恢復(fù)到原來多孔的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。最好是讓漂浮于緩沖液的薄膜吸滿 緩沖液后自然下沉，這樣可將膜片上聚集的小氣泡趕著走。點(diǎn)樣時，應(yīng)將膜片表 面多余的緩沖液用濾紙吸去，以免緩沖液太多引起樣品擴(kuò)散。但也不能吸得太干， 太干則樣品不易進(jìn)入薄

7、膜的網(wǎng)孔內(nèi)，而造成電泳起始點(diǎn)參差不齊，影響分離效果。 吸水量以不干不濕為宜。為防止指紋感染，取膜時，應(yīng)戴指套或用鑷子。2、緩沖液的選擇醋酸纖維素薄膜電泳常選用pH8.6巴比妥溶液，其濃度為0.05mol/L0.09mol/L。選擇何種濃度與樣品及薄膜的薄厚有關(guān)。選擇時，先初 步定下某一濃度，如電泳槽兩極之間的膜長度為8 cm10cm，則需電壓25V/cm 膜長，電流強(qiáng)度為0.4mA/cm_0.5mA/cm膜寬。當(dāng)電泳達(dá)不到或超過這個值時， 則應(yīng)增加緩沖液濃度或進(jìn)行稀釋。緩沖液濃度過低，則區(qū)帶泳動速度快，并由于 擴(kuò)散變寬；緩沖液濃度過高，則區(qū)帶泳動速度慢，區(qū)帶分布過于集中不易分辨。3、加樣量加樣

8、品的多少與電泳條件、樣品的性質(zhì)、染色方法與檢測手段靈敏度密切相 關(guān)。作為一般原則，檢測方法越靈敏，加樣量則越少，對分離更有利。如加樣量 過大，則電泳后區(qū)帶分離不清楚，甚至互相干擾，染色也較費(fèi)時。如電泳后用洗 脫法定量時，每厘米加樣線上需加樣品0.1比一0.5出約相當(dāng)于5g1000Ag蛋白。 血清蛋白常規(guī)電泳分離時，每厘米加樣線加樣量不超過1出，相當(dāng)于60Ag80Ag 的蛋白質(zhì)。但糖蛋白和脂蛋白電泳時，加樣量則應(yīng)多些。對每種樣品加樣量均應(yīng) 先作預(yù)實(shí)驗(yàn)加以選擇。點(diǎn)樣好壞是獲得理想圖譜的重要環(huán)節(jié)之一，以印章法加樣時，動作應(yīng)輕、穩(wěn)，用 力不能太重，以免將薄膜弄壞或印出凹陷而影響電泳區(qū)帶分離效果。4、電

9、量的選擇電泳過程應(yīng)選擇合適的電流強(qiáng)度，一般電流強(qiáng)度為0.4mA/cm0.5mA/cm寬 膜為宜。電流強(qiáng)度高，尤其在溫度較高的環(huán)境中，可引起蛋白質(zhì)變性或由于熱效 應(yīng)引起緩沖液中水分蒸發(fā)，使緩沖液濃度增加，造成膜片干涸。電流過低，則樣 品泳動速度慢且易擴(kuò)散。5、染色液的選擇對醋酸纖維素薄膜電泳后染色應(yīng)根據(jù)樣品的特點(diǎn)加以選擇。其原則是染料對被分 離樣品有較強(qiáng)的著色力，背景易脫色；應(yīng)盡量采用水溶性染料，不宜選擇醇溶性 染料，以免引起醋酸纖維素膜溶解。應(yīng)控制染色時間。時間長，薄膜底色深不易脫去；時間短，著色淺不宜區(qū)分， 或造成條帶染色不均，必要時可進(jìn)行復(fù)染。6、透明及保存透明液應(yīng)臨用前配制，以免冰乙酸及

10、乙醇揮發(fā)影響透明效果。這些試劑最好 選用分析純。透明前，薄膜應(yīng)完全干燥。透明時間應(yīng)掌握好，如在透明乙液中浸 泡時間太長則薄膜溶解，太短則透明度不佳。透明后的薄膜完全干燥后才浸入石蠟中，使薄膜軟化。如有水，則液體石蠟 不易浸入，薄膜不易平展。六、學(xué)生實(shí)驗(yàn).電泳槽與薄膜的制備(1)醋酸纖維素薄膜的濕潤與選擇用鈍頭鑷子取一片薄膜(7 cm X2cm識別出光澤面與無光澤面，并在角上 用筆做上記號)，在薄膜無光澤面上，距邊2cm處用鉛筆各劃一條直線此線為點(diǎn) 樣標(biāo)志區(qū)。小心地平放在盛有緩沖液的平皿中。若漂浮于液面的薄膜在15s30s 內(nèi)迅速濕潤，整條薄膜色澤深淺一致，則此膜均勻可用于電泳;若薄膜濕潤緩慢，

11、 色澤深淺不一或有條紋及斑點(diǎn)，則表示薄膜厚薄不均勻應(yīng)舍去，以免影響電泳結(jié) 果，將選好的薄膜用竹夾子輕壓，使其完全浸泡于緩沖液中約20min后方可用于 電泳。(2)電泳槽的準(zhǔn)備根據(jù)電泳槽的寬度，剪裁尺寸合適的濾紙條。在兩個電極槽中，各倒等體積 的電極緩沖液，在電泳槽的兩個膜支架上，各放四層濾紙條，使濾紙的長邊與支 架前沿對齊，另一端浸入電極緩沖液內(nèi)。當(dāng)濾紙條全部浸潤后，用玻璃棒輕輕擠 壓在膜支架上的濾紙以驅(qū)趕氣泡，使濾紙的一端能緊貼在膜支架上。濾紙條是兩 個電極槽聯(lián)系醋酸纖維素膜的橋梁，因而稱為濾紙橋。2.點(diǎn)樣：用鈍頭鑷子把膜條從緩沖液中取出，夾在兩層粗濾紙內(nèi)吸干多余的 液體，然后平鋪在玻璃板上

12、（無光澤面朝上），將點(diǎn)樣器先在放置在白瓷反應(yīng)板 上的血清中沾一下，再在膜條一端1.5cm處輕輕地水平水平劃線（注意樣品線 兩頭與膜條兩側(cè)保留一定間隙），使血清完全滲透至薄膜內(nèi)，形成一定寬度、粗 細(xì)均勻的直線，此步是實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵，點(diǎn)樣前應(yīng)在濾紙上反復(fù)練習(xí)，掌握點(diǎn)樣技術(shù) 后在正式點(diǎn)樣。這樣即在膜條上點(diǎn)上了細(xì)條狀的血清樣品。3.電泳：用鈍頭鑷子將點(diǎn)樣端的薄膜平貼在陰極電泳槽支架的濾紙橋上（點(diǎn) 樣面朝下），另一端平貼在陽極端支架上。要求薄膜緊貼濾紙橋并繃直，中間不 能下垂，如一電泳槽同時安放幾張薄膜，則薄膜之間應(yīng)隔幾毫米，蓋上電泳槽蓋 使薄膜平衡10min。用導(dǎo)線將電泳槽的正、負(fù)極與電泳儀的正、負(fù)極分別

13、連接，注意不要接錯。在室 溫下電泳，打開電源開關(guān)，調(diào)節(jié)電壓為90-110V，電流為0.4-0.6mA/cm（8塊薄 膜則為3.2-4.8mA）。電泳時間約40min60min。電泳后調(diào)節(jié)旋鈕使電流為零， 關(guān)閉電泳儀切斷電源或自然風(fēng)干。4、染色與漂洗：用鈍頭鑷子取出電泳后的薄膜，無光澤面向上，放在含有 0.5%氨基黑10B染色液的培養(yǎng)皿中，浸染5-10min。取出后用自來水沖去多余染 料，然后放到盛有漂洗液的培養(yǎng)皿中，每隔10min換漂洗液一次，連續(xù)數(shù)次，直 至背景藍(lán)色脫盡。取出后放在濾紙上吸干?？傻蒙珟逦碾娪緢D譜。每人一個電泳樣品進(jìn)行實(shí)驗(yàn)（四個共用一個電泳儀和臥式電泳槽）；注意仔 細(xì)觀察實(shí)

14、驗(yàn)現(xiàn)象，準(zhǔn)確記錄實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，實(shí)驗(yàn)報告記錄完成電泳所需時間，學(xué)習(xí)樣 品的染色和漂洗；要求實(shí)驗(yàn)前預(yù)習(xí)，并繳交預(yù)習(xí)報告和實(shí)驗(yàn)報告。方法評估1、醋酸纖維素薄膜與濾紙相比較，有以下優(yōu)點(diǎn)（1）醋酸纖維素薄膜對蛋白質(zhì)樣品吸附極少，無“拖尾”現(xiàn)象，染色后背 景能完全脫色，各種蛋白質(zhì)染色帶分離清晰，因而提高了測定的精確性。（2）快速省時。由于醋酸纖維素薄膜親水性較濾紙小，薄膜中所容納的緩 沖液也較少，電滲作用小，電泳時大部分電流是由樣品傳導(dǎo)的，所以分離速度快， 電泳時間短，一般電泳4560min即可，加上染色，脫色，整個電泳完成僅需 90min左右。（3）靈敏度高，樣品用量少。血清蛋白僅需2p l血清，甚至加樣體積少至 0.11，僅含5p g蛋白樣品也可得到清晰的分離帶。臨床醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)利用這一點(diǎn)， 檢測在病理情況下微量異常蛋白的改變。（4）應(yīng)用面廣。某些蛋白在紙上電泳不易分離，如胎兒甲種球蛋白，溶菌 酶，胰島素，組蛋白等用醋酸纖維薄膜電泳能較好地分離。（5）醋酸纖維素薄膜電泳染色后，經(jīng)冰乙酸，乙醇混合液或其它溶液浸泡 后可制成透明的干板，有利于掃