米氏常數(shù)的測定

1、底物濃度對酶促反應(yīng)速度的影響米氏常數(shù)的測定一目的要求1.1了解底物濃度對酶促反應(yīng)的影響。1.2掌握測定米氏常數(shù)K的原理和方法。m二實驗原理酶促反應(yīng)速度與底物濃度的關(guān)系可用米氏方程來表示：vVsvKsm式中：v反應(yīng)初速度（微摩爾濃度變化/min）；V最大反應(yīng)速度（微摩爾濃度變化/min）；s底物濃度（mol/L）；K米氏常數(shù)（mol/L）。m這個方程表明當已知Km及V時，酶促反應(yīng)速度與底物濃度之間的定量關(guān)系。Km值等于酶促反應(yīng)速度達到最大反應(yīng)速度一半時所對應(yīng)的底物濃度，是酶的特征常數(shù)之一。不同的酶，Km值不同，同一種酶與不同底物反應(yīng)Km值也不同，Km值可以近似地反應(yīng)酶與底物的親和力大?。篕m值越

2、大，表明親和力小；Kmmmm值小，表明親和力大。則測Km值是酶學研究的一個重要方法。大多數(shù)純酶的K值在0.01100mmol/L。mLinewaeaver-Burk作圖法（雙倒數(shù)作圖法）是用實驗方法測Km值的最常用的簡便方法：1K.11m.vVsV實驗時可選擇不同的s實驗時可選擇不同的s，測定對應(yīng)的V,11以v對而作圖，得到一個斜率為的直線，其截距右則為K-，由此可求出Km的值（截距的負倒數(shù)）。m本實驗以胰蛋白酶消化酪蛋白為例，采用Linewaeaver-Burk雙倒數(shù)作圖法測定雙倒數(shù)作圖法。胰蛋白酶催化蛋白質(zhì)中堿性氨基酸（L-精氨酸和L-賴氨酸）的羧基所形成的肽鍵水解。水解時有自由氨基生成，

3、可用甲醛滴定法判斷自由氨基增加的數(shù)量而跟蹤反應(yīng)，求得初速度。三試劑和器材3.1試劑103Og/L的酪蛋白溶液（pH8.5）：分別取10、20、25、30g酪蛋白溶于約900mL水中，加20mL1mol/LNaOH連續(xù)振蕩，微熱直至溶解，以1mol/LHCl或1mol/LNaOH調(diào)pH至8.5，定容1L,即生成四種不同s的酪蛋白標準溶液。中性甲醛溶液：100mL分析甲醛加20mL0.25%酚酞乙醇溶液，以0.1mol/LNaOH滴至微紅,密閉于玻璃瓶中。0.25%酚酞乙醇溶液：2.5g酚酞以50%乙醇溶解，并定容至1L。標準0.1mol/LNaOH溶液：事先用鄰苯二甲酸氫鉀標定過。材料胰酶溶液：

4、稱取3g胰酶（胰蛋白酶、胰淀粉酶、胰脂肪酶的混合物）溶于25ml蒸餾水中，放入冰箱保存。器材恒溫水浴；50ml三角燒瓶（X16）,150ml三角燒瓶（X4）；吸管5ml（X1）,10ml（X5）；量筒100ml（X4）；25ml堿式滴定管及滴定臺，蝴蝶夾；恒溫水浴；滴管。四操作方法取50mL三角瓶4個，加入5mL甲醛與1滴酚酞，以0.1mol/L標準NaOH滴定至微紅色，4個瓶顏色應(yīng)當一致，編號。量取30g/L酪蛋白50mL，加入一150mL三角瓶，37C保溫10min,然后吸取5mL酶液加到酪蛋白液中。（同時計時！充分混合后立即取出10mL反應(yīng)液（定為0號樣品）加入一含甲醛的小三角瓶中（1號

5、）加10滴酚酞。以0.1mol/LNaOH毫升數(shù)，記下耗去的0.1mol/L標準NaOH的毫升數(shù)。在2min，4min，6min時，分別取出10mL反應(yīng)液，加入2號，3號，4號小三角瓶，同上操作，記下耗去NaOH的毫升數(shù)。以滴定度（即NaOH的毫升數(shù)）對時間作圖，得一直線，其斜率即初速度為V40（相對于40g/L的酪蛋白濃度）。然后分別量取25g/L，20g/L，10g/L的酪蛋白溶液，重復(fù)上述操作，分別測出V25、V20、V10。利用上述結(jié)果，以1/v對1/s作圖，即求出V與Km值。五實驗數(shù)據(jù)處理5.1.實驗原始數(shù)據(jù)記錄：如表1中所示。表1實驗數(shù)據(jù)記錄頭驗號（酶解時間/min）1(0)2(2

6、)3(4)4(6)酪蛋白濃度NaOH消耗的體積/ml10g/L0.881.321.521.7420g/L1.191.672.072.3525g/L1.511.872.292.8030g/L1.511.982.532.995.2相對各濃度酪蛋白的各初速度值以滴定度（即NaOH的毫升數(shù)）對時間作圖，得一直線，其斜率即初速度值。（1）相對于10g/L酪蛋白的初速度Vi。根據(jù)數(shù)據(jù)作圖得圖1-1。由圖1-1中得直線方程y=0.139x+0.948，其斜率為即為V20=0.194g/Lmin。66yno-194x+1-2300R,990068(3)0.215.NmOH消耗量/mLoOIn1O-I1L2in

7、NaOH消耗量/mL1In2oLnNmOH消耗/mLoOInyH9215X+1.474吧H99939yH0-250X+1-504IVH0-99OOOOTOC o 1-5 h z HYPERLINK l bookmark48根據(jù)數(shù)據(jù)作圖得圖1-4。由圖1-4中得直線方程y=0.250+1.504，其斜率為0.250,即為V30=0.250g/。5.3求解V與Km值表2求得的v與s值酪蛋白濃度s/(g/L)1/s初速度v/(g/Lmin)1/v HYPERLINK l bookmark52100.1000.1397.194 HYPERLINK l bookmark54200.0500.1945.1

8、55 HYPERLINK l bookmark56250.0400.2154.651實驗表明，反應(yīng)速度只在最初一段時間內(nèi)保持恒定，隨著反應(yīng)時間的延長，酶促反應(yīng)速度逐漸下降。原因有多種，如底物濃度降低，產(chǎn)物濃度增加而對酶產(chǎn)生抑制并加速逆反應(yīng)的進行，酶在一定PH及溫度下部分失活等。因此，研究酶的活力以酶促反應(yīng)的初速度為準。在本實驗中，圖1-1和1-2線性不是很理想，可能的原因有：（1）酶促反應(yīng)的時間沒有得到嚴格的控制（2）實驗所用的酶是粗酶液，是胰酶溶液是胰蛋白酶、胰淀粉酶和胰脂肪酶的混合物，并不是純酶。我們知道酶的催化具有高度的專一性，一種酶只能作用于特定的底物，所以本實驗中所用的酶不能準確反應(yīng)

9、酶作用于底物的反應(yīng)速度。七思考題試述底物濃度對酶促反應(yīng)速度的影響。在生化反應(yīng)中，若酶的濃度為定值，底物的起始濃度較低時，酶促反應(yīng)速度與底物濃度成正比，反應(yīng)相對于底物是一級反應(yīng)。在較高的底物濃度下，酶被飽和，進一步提高底物濃度，反應(yīng)速度提高，但并不是成比例增加，反應(yīng)相對于底物是混合級反應(yīng)。當所有的酶與底物結(jié)合生成中間產(chǎn)物后，即使再增加底物濃度，中間產(chǎn)物濃度也不會增加，酶促反應(yīng)速度也不增加，反應(yīng)相對于底物是個零級反應(yīng)。在實際測定中，即使酶濃度足夠高，隨底物濃度的升高，酶促反應(yīng)速度并沒有因此增加，甚至受到抑制。其原因是：高濃度底物降低了水的有效濃度，降低了分子擴散性，從而降低了酶促反應(yīng)速度。過量的底物聚集在酶分子上，生成無活性的中間產(chǎn)物，不能釋放出酶分子，從而也會降低反應(yīng)速度。在什么條件下，測定酶的Km值可以作為鑒定酶的一種手段，為什么？當酶作用的底物是酶的最適底物時，并且在最適的pH最適溫度以及離子強度等條件下，測定酶的Km值可以作為鑒定酶的一種手段。因為同一種酶的不同底物作用，不同pH、溫度以及離子強度等條件下測定的Km值是不同的。米式方程中的Km值有何實際應(yīng)用？鑒定酶：通過測定Km,可鑒別不同來源或相同來源但在不同發(fā)育階段、不同生理狀態(tài)下催化相同反應(yīng)的酶是否屬于同一種酶。判斷酶的最適底物：一種酶如果可以作用于幾個底物，就有幾個Km值。測定各種底物的Km值，Km最