基因定點(diǎn)突變技術(shù)

1、基因定點(diǎn)突變技術(shù)第一頁，共十六頁。定點(diǎn)突變定點(diǎn)突變是指通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）等方法向目的DNA片段（可以是基因組，也可以是質(zhì)粒）中引入所需變化（通常是表征有利方向的變化），包括堿基的添加、刪除、點(diǎn)突變等。定點(diǎn)突變能迅速、高效的提高DNA所表達(dá)的目的蛋白的性狀及表征，是基因研究工作中一種非常有用的手段。第二頁，共十六頁。定點(diǎn)突變的目的基因定點(diǎn)的突變是指按照設(shè)計(jì)的要求，使基因的特定序列發(fā)生插入、刪除、置換和重排等變異。體外定點(diǎn)突變技術(shù)是研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能之間關(guān)系的有力工具。蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)決定其功能，對某個(gè)已知基因的特定堿基進(jìn)行定點(diǎn)改變，缺失或者插入，可以改變對應(yīng)的氨基酸序列和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能

2、，改造酶的不同活性或者動力學(xué)特性。第三頁，共十六頁。寡核苷酸介導(dǎo)的基因突變指用含有突變堿基的寡聚核苷酸片斷作為引物，在聚合酶的作用下啟動DNA分子進(jìn)行復(fù)制。盒式突變是利用一段人工合成的含基因突變序列的寡核苷酸片段，取代野生型基因中的相應(yīng)序列。PCR介導(dǎo)的基因突變定點(diǎn)突破的方法第四頁，共十六頁。寡核苷酸介導(dǎo)的定點(diǎn)突變寡聚核苷酸定點(diǎn)誘變技術(shù)是由加拿大的生物化學(xué)家( michael smith )發(fā)明的.第五頁，共十六頁。寡核苷酸定點(diǎn)突變基本原理合成一段寡聚脫氧核糖核苷酸作為引物，使其與帶有目的基因完全互補(bǔ)。合成的寡核苷酸引物除短的錯(cuò)配區(qū)外，與目的基因完全互補(bǔ)。然后用DNA聚合酶使寡核苷酸引物延伸，

3、完成單鏈DNA的復(fù)制。由此產(chǎn)生的雙鏈DNA，一條鏈為野生型親代鏈，另一條為突變型子代鏈。將獲得的雙聯(lián)分子通過轉(zhuǎn)導(dǎo)入宿主細(xì)胞，并篩選出突變體其中基因已被定向修改第六頁，共十六頁。第七頁，共十六頁。盒式突變1985年Wells提出的一種基因修飾技術(shù)盒式突變。盒式突變：用一段人工合成具有突變序列的DNA片段，取代野生型基因中的相應(yīng)序列。然而，并非所有變異區(qū)附近都能找到合適的限制位點(diǎn)，如果不存在限制位點(diǎn)，就要用寡核苷酸指導(dǎo)的定位誘變引入限制位點(diǎn)。第八頁，共十六頁。第九頁，共十六頁。PCR介導(dǎo)的定點(diǎn)突變在最初所建立的PCR方法中就可看出只要引物帶有錯(cuò)配堿基便可使PCR產(chǎn)物的末端引入突變。但是誘變部分并不

4、總在DNA的中間部分進(jìn)行誘變。目前采用重組PCR進(jìn)行定位誘變，可以在DNA片段的任意部位產(chǎn)生定位突變。第十頁，共十六頁。重疊延伸的介導(dǎo)的突變第十一頁，共十六頁。大引物誘導(dǎo)法第十二頁，共十六頁。定位突變用途定點(diǎn)突變法的應(yīng)用不僅廣泛用于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，還可用于農(nóng)業(yè)培育抗蟲、抗病的良種，用于醫(yī)學(xué)矯正遺傳病、治療癌癥等病。定點(diǎn)突變技術(shù)的潛在應(yīng)用領(lǐng)域很廣，比如研究蛋白質(zhì)相互作用位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)、改造酶的不同活性或者動力學(xué)特性，改造啟動子或者DNA作用元件，引入新的酶切位點(diǎn)，提高蛋白的抗原性或者是穩(wěn)定性、活性、研究蛋白的晶體結(jié)構(gòu)，以及藥物研發(fā)、基因治療等等方面。第十三頁，共十六頁。應(yīng)用前景不同于定點(diǎn)突變的是基

5、于PCR的隨機(jī)突變，通過改變PCR條件提高PCR過程中的隨機(jī)出錯(cuò)，這種方法適用于未知的蛋白質(zhì)，作全局性分析，所以有人稱為飽和突變（saturation mutagenesis）。不過這種方法由于沒有目的性，分析操作相當(dāng)繁瑣，并且不會出現(xiàn)一個(gè)位點(diǎn)2個(gè)以上堿基突變，因而應(yīng)用上有局限性。定點(diǎn)突變適用于蛋白結(jié)構(gòu)已有初步了解的基因，比PCR隨機(jī)突變更有目的性，也更為精確，簡單，同時(shí)改造基因更加“隨心所欲”。由于定點(diǎn)突變技術(shù)在蛋白質(zhì)組學(xué)中有這非常廣泛的應(yīng)用前景，相信這個(gè)技術(shù)在不遠(yuǎn)的將來還會有更大的改進(jìn)和發(fā)展，也必將為更多人熟悉應(yīng)用。 第十四頁，共十六頁。在分子生物學(xué)和基因工程中的應(yīng)用探明未知序列的結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系，如啟動子誘變篩選，真 核的TATA盒保守序列確定。載體構(gòu)建：調(diào)控元件，強(qiáng)啟動子，多接頭。研究基因調(diào)控序列，如AUG前加入ACC序列最佳。第十五頁，共十六頁。在蛋白質(zhì)工程中的應(yīng)用降低毒性，如TNF改變亞型和種的特異性，如IFN的23位AAG（賴氨酸），AGG（精氨酸），使IFN2a變成IFN2b。123位Try（酪）變甘/絲，使IFN種屬特異性明顯改變，對人抗病毒活性