食品微生物學(xué) 第六章課件

1、第六章 食品中的微生物 及其產(chǎn)物的鑒定微生物檢測(cè)技術(shù)：定量： 微生物數(shù)量的測(cè)定定性：根據(jù)各種性狀特征，對(duì)微生物 的種類鑒別。傳統(tǒng)食品微生物檢測(cè)：以分離、純化、培養(yǎng)為 基礎(chǔ)現(xiàn)代食品微生物檢測(cè)：新理論、新技術(shù)遺傳學(xué)特性、細(xì)胞組分、數(shù)值分類 快速、靈敏、特異第一節(jié) 食品中微生物數(shù)量的檢測(cè)方法檢測(cè)食品中微生物總數(shù)的方法：1）活細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)平板計(jì)數(shù)法 （Standard plate count, SPC）2）最近似數(shù)測(cè)定法 （most probable number,MPN）檢測(cè)食品中微生物總數(shù)的方法：3）染色還原技術(shù)估算具有還原能力的 各種細(xì)胞的總數(shù)4）顯微鏡直接計(jì)數(shù)法（DMC）菌落總數(shù)： 在一定條件下

2、（需氧、溫度、時(shí)間、pH)每克（每毫升）食品檢驗(yàn)所生長(zhǎng)出來的CFU（菌落形成單位）。國標(biāo)規(guī)定： 在需氧條件下： 細(xì)菌 NA 37 48h 霉菌 酵母 PDA 2528 5天（一）樣品采集1、采樣原則： 代表性 防止污染2、采樣的種類： 大樣 一整批樣品 中樣 200g 小樣 分析的樣品（檢樣）25g3、采樣方法： 無菌操作 采樣用具必須無菌 盡量采集有包裝的食品 粉末狀樣品 邊取樣邊混合 液體樣品 邊振搖邊混合 冷凍食品 保持冷凍狀態(tài) 非冷凍食品 保存在05 4、采樣數(shù)量和部位： 200g/件 乳制品 一瓶（個(gè)、罐、聽） 糧 三層五點(diǎn)（表、中、下） 油 重點(diǎn)采取表層及底層油5、采樣標(biāo)簽： 名稱

3、 來源 數(shù)量 編號(hào) 時(shí)間.（二）送檢 從采樣到實(shí)驗(yàn)室越快越好 不得超過3h3）稀釋 4）傾注1 ml1 ml1 ml1ml9ml9ml9ml9ml1ml1 ml1 ml1ml1ml1ml5）傾注平板 稀釋液移入平皿后，將46 的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基注入平皿約15mL,轉(zhuǎn)動(dòng)平皿。 空白對(duì)照（四）菌落計(jì)數(shù)法 肉眼觀察 放大鏡 TTC（氯化三苯基四氮唑) 顯色（五）菌落計(jì)數(shù)的報(bào)告 報(bào)告單位： cfu/g(mL)1、平板菌落數(shù)的選擇： 303002、稀釋度的選擇：（五）菌落計(jì)數(shù)的報(bào)告3、菌落數(shù)的報(bào)告： 100以內(nèi)時(shí) 按實(shí)數(shù)報(bào)告 大于100時(shí) 兩位有效數(shù)字 16400 16000涂布平板法 先倒平板 待凝固后

4、，吸取0.1ml稀釋液于平板表面上，用滅菌涂布棒在整個(gè)平板上均勻涂布，培養(yǎng) 觀察。涂布法的優(yōu)缺點(diǎn)可檢測(cè)到熱敏性菌體菌落形態(tài)比較明顯更適合于嚴(yán)格的好氧菌沒有傾注法簡(jiǎn)便，易出現(xiàn)菌落重疊、混雜現(xiàn)象二、旋轉(zhuǎn)接種法（Spiral plate method） 1970年 FDA原理： 接種針將樣品液以螺旋方式從平板中央往外連續(xù)接種。 接種量：0.05mL優(yōu)點(diǎn)：可測(cè)定50500000cfu/mL的菌數(shù)樣品不需事先稀釋不需做2個(gè)重復(fù)接種速度快結(jié)果可人工計(jì)數(shù)，也可用激光計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)人力與物力花費(fèi)成本低廉測(cè)定結(jié)果與傳統(tǒng)方法相關(guān)性高菌落計(jì)數(shù)的其它方法 膜過濾 MPN 染色還原計(jì)數(shù)法 DMC三、膜過濾SPC方法的改良

5、過濾膜的孔徑 0.45um 收集菌體 提高檢出率 直接顯微計(jì)數(shù) 膜過濾與熒光染色方法結(jié)合DEFT微菌落計(jì)數(shù) 僅用于活細(xì)胞的檢測(cè) 原理： 食品勻液經(jīng)DEFT膜過濾，膜放在培養(yǎng)基表面，恒溫培養(yǎng)至微菌落長(zhǎng)出，顯微鏡觀察 G- 3h G+ 6h快速檢測(cè)技術(shù) 特殊濾膜（0.5um）過濾樣品液 濾膜經(jīng) 啶橙染色 紫外光顯微鏡觀察 活細(xì)胞 橙色熒光 死細(xì)胞 綠色熒光 2030min四、最近似數(shù)測(cè)定法（MPN） 選擇3個(gè)稀釋梯度的稀釋液，每種稀釋液接種3管（5管）裝有培養(yǎng)基的試管中培養(yǎng)，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果查MPN檢索表，得到樣品中微生物數(shù)量。 1915年 McCrady發(fā)明MPN的優(yōu)點(diǎn)：方法相對(duì)簡(jiǎn)單與SPC相比，相

6、似率較高用選擇性培養(yǎng)基可檢測(cè)特殊的微生物類群測(cè)定大腸菌群數(shù)量的方法 MPN的缺點(diǎn)：需要大量的玻璃器皿（特別是5試管實(shí)驗(yàn)）不能觀察微生物菌落的形態(tài)準(zhǔn)確性不高1、大腸菌群（coliform group） 領(lǐng)域用語 與糞便污染有關(guān)的細(xì)菌 定義： 一群需氧及兼性厭氧，在37 經(jīng)24h能分解乳糖產(chǎn)酸、產(chǎn)氣的革蘭氏陰性無芽胞桿菌。 主要包括： 大腸埃希氏菌屬 （Escherichia） 檸檬酸桿菌屬 （Citrobacter） 克雷氏菌屬 （Klebsiella） 產(chǎn)氣腸桿菌屬 （Enterobacter）非典型大腸桿菌典型大腸桿菌 目前，大腸菌群已被我國和許多國家用作食品質(zhì)量評(píng)價(jià)的指示菌。一般認(rèn)為，大腸

7、菌群都是直接或間接來自人與溫血?jiǎng)游锏募S便。 2、檢測(cè)大腸菌群的意義 糞便污染食品的指示菌 大腸菌群數(shù)的高低，表明糞便污染的程度和對(duì)人體健康危害性的大小 腸道致病菌污染食品的指示菌 大腸菌群數(shù)的高低，表明腸道致病菌存在的可能性大?。ú⒎且欢ㄆ叫校。?3、大腸菌群檢測(cè)方法與檢驗(yàn)結(jié)果 檢驗(yàn)結(jié)果：用每100mL（g）樣品中 大腸菌群最近似數(shù)來表示， 簡(jiǎn)稱大腸菌群MPN.檢測(cè)方法：乳糖發(fā)酵試驗(yàn)、分離培養(yǎng)、 證實(shí)試驗(yàn) 見GB4789.3-1994五、染色還原計(jì)數(shù)法一種估計(jì)活性微生物數(shù)量的方法。原理： 活細(xì)胞內(nèi)含有還原酶，可把特定的染料從一種顏色還原為另外一種顏色。 亞甲基藍(lán)（蘭色） 白色刃天青（暗蘭色）

8、粉紅色或 白色染色還原的時(shí)間與樣品中微生物濃度成反比兩種染料：應(yīng)用： 乳品工業(yè)上原料乳中的微生物檢測(cè)優(yōu)點(diǎn)： 簡(jiǎn)便、快捷和經(jīng)濟(jì)缺點(diǎn)： 不同的微生物還原能力不同，給估算帶來了一定的困難。 不適用于含有還原酶的食品應(yīng)用及優(yōu)、缺點(diǎn)六、顯微直接計(jì)數(shù)法（Direct microscope count, DMC）一定量的食品（0.001mL）顯微鏡載玻片（1cm2）烘干、固定、脫脂、染色復(fù)式顯微鏡計(jì)數(shù) 換算DMC方法的優(yōu)點(diǎn) 快捷 、簡(jiǎn)便 能對(duì)細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行分析 載玻片易保存，作參考可使用熒光技術(shù)增強(qiáng)效果DMC方法的缺點(diǎn) 僅適于檢含大量菌體的樣品 準(zhǔn)確性差 易造成操作人員的疲勞七、棉拭子涂抹法 表層微生物的檢測(cè)

9、 應(yīng)用于食品、 公共場(chǎng)所方法：1）無菌棉拭子蘸取滅菌生理鹽水（10mL試管）均勻涂抹樣品表面一定面積（5cmX5cm，1cmX1cm）后，放回試管中，及時(shí)送檢；2）試管振蕩，使微生物懸浮于稀釋液中；3）按SPC方法進(jìn)行梯度稀釋、培養(yǎng)、計(jì)數(shù)。 此外，紙片法第二節(jié) 物理、化學(xué)、分子和免疫方法一、物理方法 阻抗測(cè)定法 微量量熱法（一）阻抗測(cè)定法（impedance） 1899年 G.N,Stewart 估算 20世紀(jì)70年代應(yīng)用 阻抗：交流電路中導(dǎo)電物質(zhì)對(duì)電流所起的阻礙和抵抗作用，可由電導(dǎo)和電容計(jì)算。原理： 微生物可使培養(yǎng)基中電惰性底物，如碳水化合物、蛋白質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)代謝成為電活性產(chǎn)物（乳酸鹽或氨等

10、）當(dāng)微生物生長(zhǎng)繁殖時(shí)，培養(yǎng)基中的電惰性分子即為許多電活性分子所取代，從而使培養(yǎng)基的電導(dǎo)性增大，培養(yǎng)基的阻抗降低。檢測(cè)時(shí)間（detection time) 樣品接種后從開始培養(yǎng)到阻抗值發(fā)生急劇變化的時(shí)間。 與原始菌數(shù)成反比 Bactomer細(xì)菌計(jì)數(shù)器 準(zhǔn)確率 93% 10100個(gè) 5h（二）微量量熱法 （Microcalorimetry）細(xì)菌生長(zhǎng)時(shí)產(chǎn)生熱量測(cè)定微小溫度變化的儀器量熱計(jì) 批次型：早期應(yīng)用 流動(dòng)型： 靈敏、快速二、化學(xué)方法（一）熱穩(wěn)定性核酸酶（DNAse ） S. aureus G（+） 凝固酶（+） 產(chǎn)腸毒素菌株 95%產(chǎn)熱穩(wěn)定性核酸酶 耐高溫原理： 檢測(cè)食品中熱穩(wěn)定性核酸酶的含量

11、，可以精確計(jì)算出金黃色葡萄球菌的數(shù)量。 分光光度法 熱穩(wěn)定性核酸酶是S.aureus生長(zhǎng)的標(biāo)志 凝固酵素是產(chǎn)腸毒素菌株的標(biāo)志（二）ATP的測(cè)定生命體的主要能源細(xì)胞中ATP含量恒定ATP測(cè)定計(jì)數(shù)法的原理 根據(jù)ATP可與從熒火蟲中提取的熒光素酶作用發(fā)光，發(fā)光的總光量與ATP的量成正比。 光強(qiáng)度推算出細(xì)菌細(xì)胞數(shù) 液體發(fā)光分光計(jì) 照度計(jì) 結(jié)果與SPC法一致 1025min ATP檢測(cè)法的應(yīng)用： 檢測(cè)微生物數(shù)量的快速方法 醫(yī)學(xué)： 尿樣的檢驗(yàn)環(huán)境衛(wèi)生：表面微生物的測(cè)定（三）輻射測(cè)量法（Radiometric） 原理 利用細(xì)菌在代謝碳水化合物時(shí)產(chǎn)生CO2的原理，把微量元素標(biāo)記到葡萄糖或其他糖類分子中。 放射

12、能計(jì)數(shù)器放射物的種類 C-14葡萄糖 C-14甲酸鹽 C14-谷氨酸鹽放射量與菌數(shù)成正比 檢測(cè)C-14所需的時(shí)間與食品中微生物的含量成反比。應(yīng)用 醫(yī)學(xué)： “吹口氣，查胃病” 30min 食品： 微生物含量高 56h 微生物含量低 更廠三、食品微生物的指紋識(shí)別和鑒定 “指紋”概念 由于每種微生物的化學(xué)組分（DNA、蛋白質(zhì)）結(jié)構(gòu)、性能有差別及其特異性代謝產(chǎn)物等通過分析技術(shù)出現(xiàn)的特征性的圖譜（一）血清學(xué)方法特殊的抗體鑒定同源抗原 G-菌體（O）抗原 鞭毛（H）抗原熱穩(wěn)定性好 熱穩(wěn)定性差抗原（Antigen，Ag）Antigens are macromolecules that elicit an i

13、mmune response in the body. Antigens can be proteins polysaccharides conjugates of lipids with proteins (lipoproteins) and polysaccharides ( glycolipids ). Antibodies are immune system-related proteins called immunoglobulins（Ig）. Each antibody consists of four polypeptides two heavy chains and two l

14、ight chains joined to form a Y shaped molecule. 抗體（Antibody，Ab）Structure of antibody（二）噬菌體（phage）類型原理： 根據(jù)噬菌體和它的宿主細(xì)菌之間的特殊關(guān)系，用已知的噬菌體鑒定其特定的宿主細(xì)菌。（三）分子生物學(xué)方法 基因探針技術(shù) DNA擴(kuò)增法 限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性技術(shù) 脈沖場(chǎng)凝膠電泳1.基因探針技術(shù)探針（Probe）：經(jīng)過標(biāo)記的一段短核苷酸，用于檢測(cè)與之同源的核苷酸序列。Probe is a short labelled nucleotide used to detect homologous nucleo

15、tide sequence .Length of probe： 20-1000bpType of probe： Oligonucleotide probes （20-40 bp）Single stranded DNA probes （200-500 bp ）Double stranded DNA probes RNA probes or Riboprobes Radioactive ：32P、35S、 3H、14CDigoxigenin （Dig）BiotinFluorescent dyeChoice of Labelling： Non-radioactive ：UnknownDNAColon

16、y hybridization 可檢測(cè)的細(xì)胞數(shù)量： 106 -107 必須進(jìn)行細(xì)胞富集 ！ 探針檢測(cè)的靈敏度與檢測(cè)時(shí)間細(xì)胞數(shù)量為 108，檢測(cè)需要10-12h 2.DNA擴(kuò)增法（1）多聚酶鏈反應(yīng) Polymerase Chain Reaction，PCR 1985年，美國PE-Cetus 公司人類遺傳學(xué)研究室的Kary Mullis 發(fā)明 1993年，Mullis 獲得諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)PCR的基本原理DNA的結(jié)構(gòu)DNA double helixDNA的復(fù)制DNA semi-conserved replication三步曲： 變性（Denaturation） 退火（Annealling） 延伸（Ex

17、tension）一個(gè)循環(huán)（cycle）一般進(jìn)行25-30個(gè)循環(huán)PCR反應(yīng)的三步曲與五要素 Step 1：雙鏈DNA熱變性（94）；Step 2：引物與模板單鏈DNA退火（55）；Step 3：DNA的聚合延伸反應(yīng)（72）；Step 4：擴(kuò)增的雙鏈DNA再次熱變性（返回Step 1）。五要素： 模板DNA（template） 引物（Primer） DNA聚合酶（Polymerase） 緩沖液（Buffer，Mg+） 脫氧核糖核苷三磷酸（dNTPs）循環(huán)次數(shù)與產(chǎn)物的量實(shí)際：Nf = N0 （1 + Y）N其中Y為擴(kuò)增效率理論：Nf = N0 X 2 N 其中N為循環(huán)次數(shù)，N0為起始拷貝數(shù)，Nf為最

18、終拷貝數(shù)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳Denaturing94 oCTemperature100055T i m e5335PCRDenaturing94 oCTemperature100055T i m e3553HeatDenaturing94 oCAnnealingPrimers55 oCExtension72 oCTemperature100055T i m e355355Denaturing94 oCDenaturing94 oCDenaturingng94 oCAnnealingPrimers55 oCExtension72 oCTemperature100055T i m e30

19、 x3553HeatHeat555Denaturing94 oCDenaturing94 oCAnnealingPrimers55 oCExtension72 oCTemperature100055T i m e30 x3553555555PCR Products With Each Thermal Cycle0CyclesNumber1382412416532664（2）隨機(jī)擴(kuò)增的多態(tài)性DNA Random Amplified Polymorphic DNA （RAPD）Developed by Williams et al. (1990) using 10 base primers to

20、generate random fragments from template DNAsRAPD fragments can be separated and used as genetic markers or a kind of DNA fingerprint Two related techniques: 1. Arbitrary Primed PCR (AP-PCR) Welsh and McClelland (1990) longer primers(18-25 bases)2. DNA Amplification Fingerprinting (DAF) Caetano-Anoll

21、es et al. (1991) very short primers (8 bases) Components of PCR and RAPD RAPD1. Buffer (Mg+) usually high Mg+ concentration2. Template DNA1 short primer (10 bases) anneals to any specific part of the template DNA4. dNTPs5. Taq PCR1. Buffer (Mg+)2. Template DNA2 Primers that flank the fragment of DNA

22、 to be amplifieddNTPs5. TaqTwo modifications made to typical thermal cycling when RAPD is being done:Annealing temperatures are generally very low, around 36 C - This allows very short primers to anneal to template DNAMore thermal cycles are used, typically 45 - This compensates for the inefficiency

23、 which results from using such short primers.Template DNAPrimer binds to many locations on the template DNAOnly when primer binding sites are close and oriented in opposite direction so the primers point toward each other will amplification take placeRAPDTemplate DNAPrimers point away from each othe

24、r, so amplification wont happenRAPDTemplate DNAPrimers point in the same direction, so amplification wont happenRAPDTemplate DNAPrimers too far apart, so amplification wont happen 2,000 basesRAPDTemplate DNAPrimers are just the right distance apart, so fragment is amplified100 - 1,500 basesRAPDMM2 3

25、 4 5 6 7 8 9 10RAPD 產(chǎn)物的電泳圖譜PCR Machine3.限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性技術(shù)（RFLP）Restriction Fragment Length Polymorphism（1）限制性內(nèi)切酶 (Restriction endonuclease）保護(hù)細(xì)菌不受外來DNA侵入來自細(xì)菌的一種內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶的特點(diǎn)：識(shí)別4-8 bp特定序列 (site specific)兩股DNA上各產(chǎn)生一個(gè)切口回文序列 (palindrome sequence)5- GTTACATGA GATC ACGGATTC -33- CAATGTACT CTAG TGCCTAAG -5產(chǎn)生粘性末端 (

26、cohesive end, sticky end)5- GTTACATGAG3- CAATGTACTCTTAAEcoR I5- TTACATGC3- AATGTACG GCMsp IAATT CACGGATTC -3 GTGCCTAAG -5CG GACGGAT -3 CTGCCTA -55- GTTACATGAG3- CAATGTACTCTTAAAATT CACGGATTC 3 GTGCCTAAG -55- TTACATGC3- AATGTACG GCCG GACGGAT -3 CTGCCTA -55-ACGGATTCGTT3-TGCCTAAGCAAHpa I5- AACTGTCGG3- T

27、TGACAGCCHae IIIAACGTTACATGA 3TTGCAATGTACT 5CCAGGCTG -3GGTCCGAC -5產(chǎn)生平末端(blunt end)5-ACGGATTCGTT3-TGCCTAAGCAAAACGTTACATGA 3TTGCAATGTACT 55- AACTGTCGG3- TTGACAGCCCCAGGCTG -3GGTCCGAC -5（2）限制性圖譜 (Restriction map）（3）限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性 (RFLP）4.脈沖場(chǎng)凝膠電泳技術(shù) Pulsed Field Gel Electrophoresis （PFGE）四、免疫學(xué)方法精確性 (Accurate)靈

28、敏性 (Sensitive)特異性 (Specific)（一）熒光抗體法（FA）（Fluorescence antibody） 1942年創(chuàng)立，在食品和醫(yī)學(xué)微生物中應(yīng)用廣泛。 原理：抗體與熒光物質(zhì)結(jié)合而帶有熒光，與相應(yīng)抗原結(jié)合后，在熒光顯微鏡下可以觀察，也可計(jì)數(shù)。熒光素：異硫氰酸熒光素（FITC）若丹名B（Rhodamine B）（二）沙門氏菌1-2實(shí)驗(yàn)（1-2 Test）原理： 血清學(xué)原理 , 即抗原抗體結(jié)合形成肉眼可見的免疫帶。一種檢測(cè)有動(dòng)力的沙門氏菌的方法 在一個(gè)特殊的含兩個(gè)容器的塑料設(shè)備中進(jìn)行： 一個(gè)容器中裝有選擇性液體培養(yǎng)基，另一個(gè)中裝有非選擇性運(yùn)動(dòng)性培養(yǎng)基（半固體），并含有鞭毛抗體

29、。 恒溫培養(yǎng)時(shí)，運(yùn)動(dòng)性沙門氏菌經(jīng)選擇性培養(yǎng)后進(jìn)入非選擇性培養(yǎng)基，并與其中的抗體結(jié)合形成免疫帶。Inoculationchamber優(yōu)點(diǎn)：將血清學(xué)反應(yīng)和生化增菌過程結(jié) 合起來，特異性強(qiáng)； 不需特殊實(shí)驗(yàn)室條件，簡(jiǎn)便 ； 8-14小時(shí)內(nèi)得出結(jié)果，快速 。缺點(diǎn)：不能檢測(cè)非運(yùn)動(dòng)型沙門氏菌， 免疫條帶的判斷有主觀因素。（三）酶聯(lián)免疫吸附劑測(cè)定 Enzyme Linked Immunosorbent Assay1971年Engvall和Perlmann（ ELISA） can measure antibodies or antigens inexpensive, rapid, quantitative, s

30、pecific sensitive (pg/ml) expensive equipment not required can be automated ELISA的基礎(chǔ)是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標(biāo)記。 結(jié)合在固相載體表面的抗原或抗體仍保持其免疫學(xué)活性，酶標(biāo)記的抗原或抗體既保留其免疫學(xué)活性，又保留酶的活性。原理：待測(cè)樣品與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)，加入酶標(biāo)記的抗原或抗體也結(jié)合在固相載體上。此時(shí)固相上的酶量與樣品中受檢物質(zhì)的量呈一定的比例。加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化成有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與樣品中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據(jù)呈色的深淺進(jìn)行定性或定量分析。 ELISA可用于測(cè)定抗原或抗體。測(cè)定中有三個(gè)必要的試劑：（1）固相的抗原或抗體，即“免疫吸附劑” （immunosorbent）；（2）酶標(biāo)記的抗原或抗體，稱為“結(jié)合物” （conjugate）；（3）酶反應(yīng)的底物（substrate）。 固相載體 固相載體作為吸附劑和容器，不參與化學(xué)反應(yīng)。最常用的是聚苯乙烯，具較強(qiáng)的吸附蛋白質(zhì)的性能，抗體或蛋白質(zhì)抗原吸附其上后仍保留原來的免疫學(xué)活性，且價(jià)格低廉，故被普遍采用。 載體的形狀主要有三