熒光分光光度法解析課件

1、第6章.熒光分光光度法6.1 概述6.2 方法原理6.3 熒光分析法6.4 熒光分光光度法在生物工程分析中的應(yīng)用第6章.熒光分光光度法6.1 概述6.1 概述6.1 概述熒光蛋白質(zhì)在2008年10月8日，諾貝爾獎委員會將化學(xué)獎授予日本化學(xué)家下村修（Osamu Shimomura）、美國科學(xué)家馬丁沙爾菲（Martin Chalfie）和美籍華裔科學(xué)家錢永健（Roger Y. Tsien）三人，以表彰他們“發(fā)現(xiàn)和發(fā)展了綠色熒光蛋白質(zhì)（Green Fluorescent Protein, GFP）”技術(shù)。 熒光蛋白質(zhì)在2008年10月8日，諾貝爾獎委員會將化學(xué)獎授予用綠色熒光蛋白標記的細胞 用綠色熒

2、光蛋白標記的細胞 用這種能自己發(fā)光的熒光分子來作為生物體(細胞、細胞器)的標記。將這種熒光分子通過化學(xué)方法掛在其他不可見的分子上，原來不可見的部分就變得可見了。 用這種能自己發(fā)光的熒光分子來作為生物體(細胞、細胞器)的標記熒光染料 能發(fā)出熒光的染料。在吸收可見光和紫外光后，能把紫外光轉(zhuǎn)變?yōu)椴ㄩL較長的可見光波而反射出來，呈閃亮的鮮艷色彩。用于增白洗衣粉中的增白劑，指示信號用的各種熒光路標漆，熒光標志服等。 熒光染料 能發(fā)出熒光的染料。在吸收可見光和紫外光后，能把紫外熒光增白劑 它的特性是能激發(fā)入射光線產(chǎn)生熒光，使所染物質(zhì)獲得類似熒石的閃閃發(fā)光的效應(yīng)，使肉眼看到的物質(zhì)很白，達到增白的效果。 其作用

3、是把制品吸收的不可見的紫外線輻射轉(zhuǎn)變成紫藍色的熒光輻射，與原有的黃光輻射互為補色成為白光，提高產(chǎn)品在日光下的白度。 熒光增白劑 它的特性是能激發(fā)入射光線產(chǎn)生熒光，使所染物質(zhì)獲得6.2 方法原理6.2.1熒光（磷光）產(chǎn)生機理6.2.2.1 分子能級與躍遷 分子能級比原子能級復(fù)雜； 在每個電子能級上，都存在振動、轉(zhuǎn)動能級； 基態(tài)(S0)激發(fā)態(tài)(S1、S2、激發(fā)態(tài)振動能級)：吸收特定頻率的輻射； 激發(fā)態(tài)基態(tài)：多種途徑和方式(見能級圖)；速度最快、激發(fā)態(tài)壽命最短的途徑占優(yōu)勢； 第一、第二、電子激發(fā)單重態(tài) S1 、S2 ； 第一、第二、電子激發(fā)三重態(tài) T1 、 T2 。10/15/20226.2 方法原

4、理6.2.1熒光（磷光）產(chǎn)生機理10/11/2熒光F 磷光P 壽命10-7-10-9 S壽命10-4-10S熒光F 磷光P 壽命10-7-10-9 S壽命10-4-10單重態(tài) 所有電子自旋都配對的分子的電子狀態(tài)。大多數(shù)有機物分子的基態(tài)是單重態(tài)。當基態(tài)一對電子中的一個被激發(fā)到較高能級，其自旋方向不會立刻改變，分子仍處于單重態(tài)。6.2.2.2 電子激發(fā)態(tài)的多重態(tài)單重態(tài) 6.2.2.2 電子激發(fā)態(tài)的多重態(tài)三重態(tài)：有兩個電子的自旋不配對而平行的狀態(tài)。熒光分光光度法解析課件S2S1S0T1吸收發(fā)射熒光發(fā)射磷光系間竄躍內(nèi)轉(zhuǎn)移振動弛豫能量l 2l 1l 3 外轉(zhuǎn)移l 2T2內(nèi)轉(zhuǎn)移振動弛豫10-14-10-1

5、2S10-13-10-11S10-2-10-4S10-4-10S10-9-10-7SS2S1S0T1吸發(fā)發(fā)系間竄躍內(nèi)轉(zhuǎn)移振動弛豫能l 2l 1l6.2.2.3 激發(fā)態(tài)基態(tài)的能量傳遞途徑 電子處于激發(fā)態(tài)是不穩(wěn)定狀態(tài)，返回基態(tài)時，通過輻射躍遷(發(fā)光)和無輻射躍遷等方式失去能量。傳遞途徑輻射躍遷熒光延遲熒光磷光內(nèi)轉(zhuǎn)移外轉(zhuǎn)移系間竄躍振動弛豫無輻射躍遷 激發(fā)態(tài)停留時間短、返回速度快的途徑，發(fā)生的幾率大，發(fā)光強度相對大。熒光：時間較短,第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動能級基態(tài)。磷光：自旋禁阻，時間較長，第一激發(fā)三重態(tài)的最低振動能級基態(tài)。6.2.2.3 激發(fā)態(tài)基態(tài)的能量傳遞途徑 電子處于激分子去活化過程及熒光的發(fā)生

6、 振動弛豫：在溶液中，處于激發(fā)態(tài)的溶質(zhì)分子與溶劑分子間發(fā)生碰撞，把一部分能量以熱的形式迅速傳遞給溶劑分子（環(huán)境），在10-1110-13 秒時間回到同一電子激發(fā)態(tài)的最低振動能級，這一過程稱為振動弛豫。分子去活化過程及熒光的發(fā)生 2. 內(nèi)轉(zhuǎn)移：當激發(fā)態(tài)S2的較低振動能級與S1的較高振動能級的能量相當或重疊時，分子有可能從S2的振動能級以無輻射方式過渡到S1的能量相等的振動能級上，這一無輻射過程稱為“內(nèi)轉(zhuǎn)換”。（“內(nèi)轉(zhuǎn)換”過程同樣也發(fā)生在三線激發(fā)態(tài)的電子能級間）2. 內(nèi)轉(zhuǎn)移：當激發(fā)態(tài)S2的較低振動能級與S1的較高振動能級3.熒光發(fā)射：當激發(fā)態(tài)的分子通過振動馳豫內(nèi)轉(zhuǎn)移振動馳豫到達第一單線激發(fā)態(tài)的最低

7、振動能級時，第一單線激發(fā)態(tài)最低振動能級的電子可通過發(fā)射輻射（光子）躍回到基態(tài)的不同振動能級，此過程稱為 “熒光發(fā)射”。如果熒光幾率較高，則發(fā)射過程較快，需10-9 10-7秒。（它代表熒光的壽命） 4.磷光發(fā)射：第一電子三線激發(fā)態(tài)最低振動能級(亞穩(wěn)態(tài))的分子以發(fā)射輻射（光子）的形式回到基態(tài)的不同振動能級，此過程稱為 “磷光發(fā)射”。熒光和磷光的根本區(qū)別: 熒光是由單重躍遷-單重引起的， 磷光則由三重躍遷-單重產(chǎn)生的。3.熒光發(fā)射：當激發(fā)態(tài)的分子通過振動馳豫內(nèi)轉(zhuǎn)移振動馳豫到6.2.2.4 分子熒光的類型分子因吸收光能而被激發(fā)，所產(chǎn)生的次級光發(fā)射現(xiàn)象稱為光致發(fā)光；分子被激發(fā)的能量是由化學(xué)反應(yīng)釋放的能

8、量所提供，其發(fā)光現(xiàn)象稱為化學(xué)發(fā)光。由生物體內(nèi)化學(xué)反應(yīng)所引起的發(fā)光現(xiàn)象，被稱為生物發(fā)光。6.2.2.4 分子熒光的類型分子因吸收光能而被激發(fā)，所產(chǎn)生熒光棒熒光棒熒光棒內(nèi)主要由過氧化物、酯類化合物和熒光染料三種化學(xué)成分構(gòu)成。熒光棒發(fā)光原理是過氧化物和酯類化合物發(fā)生反應(yīng)后，能量傳遞至熒光染料，再由染料發(fā)出熒光。熒光棒內(nèi)主要由過氧化物、酯類化合物和熒光染料三種化學(xué)成分構(gòu)成螢火蟲、水母、深海魚類發(fā)光機制是兩種物質(zhì)熒光素和熒光素酶合作產(chǎn)生的結(jié)果 螢火蟲、水母、深海魚類發(fā)光機制是兩種物質(zhì)熒光素和熒光素酶6.2.3 激發(fā)光譜與熒光光譜1. 激發(fā)光譜：將激發(fā)熒光的光源用單色器分光，連續(xù)改變激發(fā)光波長，固定熒光發(fā)

9、射波長，測定不同波長激發(fā)光下物質(zhì)溶液發(fā)射的熒光強度(I)，作I光譜圖稱激發(fā)光譜。2. 熒光光譜：選擇ex作激發(fā)光源，用另一單色器將物質(zhì)發(fā)射的熒光分光，記錄不同發(fā)射波長時的I，作 I- 光譜圖稱為熒光光譜。6.2.3 激發(fā)光譜與熒光光譜1. 激發(fā)光譜：將激發(fā)熒光的熒光分光光度法解析課件圖68蒽在乙醇溶液中的鏡像光譜圖68蒽在乙醇溶液中的鏡像光譜3.熒光光譜的特點：斯托克斯位移（Stokes shift)。與激發(fā)光譜相比，熒光光譜的波長總是出現(xiàn)在更長的波長處；熒光光譜與激發(fā)波長無關(guān)。無論用=250和350nm作激發(fā)光源，所得熒光光譜形狀和峰的位置都是相同；吸收光譜與發(fā)射光譜大致成鏡像對稱。3.熒光

10、光譜的特點：6.2.4 熒光量子產(chǎn)率與分子結(jié)構(gòu) 1.產(chǎn)生并可觀察到熒光的條件： i）分子具有與輻射頻率相應(yīng)的熒光結(jié)構(gòu)（內(nèi)因）； ii）吸收特征頻率的光后，應(yīng)可產(chǎn)生具一定量子效率的熒光。即量子效率 F足夠大：6.2.4 熒光量子產(chǎn)率與分子結(jié)構(gòu) 1.產(chǎn)生并可觀察到熒光的2.分子結(jié)構(gòu)與熒光的關(guān)系1）躍遷類型： 通常，具有*及n*躍遷結(jié)構(gòu)的分子才會產(chǎn)生熒光。而且具*躍遷的熒光效率比 n*躍遷的要大得多。2）共軛效應(yīng)： 共軛度越大，熒光越強。2.分子結(jié)構(gòu)與熒光的關(guān)系1）躍遷類型：共軛結(jié)構(gòu)與熒光的關(guān)系共軛結(jié)構(gòu)與熒光的關(guān)系共軛結(jié)構(gòu)與熒光的關(guān)系共軛結(jié)構(gòu)與熒光的關(guān)系分子結(jié)構(gòu)與熒光3）剛性結(jié)構(gòu)和共平面性： 分子剛

11、性（Rigidity）越強，分子振動少，與其它分子碰撞失活的機率下降，熒光量子效率提高。 如熒光素（ 大）與酚酞（=0）分子結(jié)構(gòu)與熒光3）剛性結(jié)構(gòu)和共平面性：（3） 剛性平面結(jié)構(gòu)酚酞(無熒光)8羥基喹啉(弱熒光)紅色熒光CO-OOCOO-COCOO-ONO-NOMgNO熒光素（3） 剛性平面結(jié)構(gòu)酚酞(無熒光)8羥基喹啉(弱熒光)紅色聯(lián)二苯 = 0.2芴 = 1.03,4-苯并芘( 強熒光物質(zhì))CH2聯(lián)二苯 = 0.2芴 = 1.03,4-苯并芘( 強剛性結(jié)構(gòu)和共平面性與熒光的關(guān)系8 羥基喹啉8 羥基喹啉鎂剛性結(jié)構(gòu)和共平面性與熒光的關(guān)系剛性結(jié)構(gòu)和共平面性與熒光的關(guān)系8 羥基喹啉8 羥基喹剛性結(jié)構(gòu)

12、和共平面性與熒光的關(guān)系7 - 二甲胺萘 1 - 磺酸鹽 F =0.758 - 二甲胺萘 1 - 磺酸鹽 F =0.03空間位阻與熒光的關(guān)系剛性結(jié)構(gòu)和共平面性與熒光的關(guān)系7 - 二甲胺萘 1 - 分子結(jié)構(gòu)與熒光4）取代效應(yīng)： 給電子取代基增強熒光（p-共軛），如 -OH、-OR、 -NH2、-CN、-NR2等； 吸電子基降低熒光，如 -COOH、 -C=O、 -NO2、-NO、-X等； 分子結(jié)構(gòu)與熒光4）取代效應(yīng)：與體系作用小的取代基影響不明顯： SO3R,NH3,SH,F,R。COOHNO2I無熒光NH2OH比熒光強50倍COOHNO2I無熒光NH2OH比熒光強50倍 取代基之間若發(fā)生氫鍵，增

13、強分子平面性和剛性會加強熒光:有熒光COOHOH無熒光OHCOOH水楊酸有熒光OHOHCO 重原子降低熒光但增強磷光， 如苯環(huán)被鹵素取代，從氟苯到碘苯，熒光逐漸減弱到消失，該現(xiàn)象也稱重原子效應(yīng)。 取代基之間若發(fā)生氫鍵，增強分子平面性和剛性會加強熒光影響熒光的外界因素（一）溶劑效應(yīng)： 溶劑極性可增加或降低熒光強度 （改變*及n* 躍遷的能量）； 與溶劑作用從而改變熒光物質(zhì)結(jié)構(gòu)來增加或降低熒光強度。影響熒光的外界因素（一）溶劑效應(yīng)： 影響熒光的外界因素（二）溫度： 溫度增加，熒光強度下降（因為內(nèi)、外轉(zhuǎn)換增加、粘度或“剛性”降低）。因此體系降低溫度可增加熒光分析靈敏度。如熒光素的乙醇溶液在0以下每降

14、低10 ，熒光效率增加3%，冷至-80時，熒光效率為100%。影響熒光的外界因素（二）溫度：如熒光素的乙醇溶液在0以下每影響熒光的外界因素（三）pH值： 具酸或堿性基團的有機物質(zhì)，在不同pH值時，其結(jié)構(gòu)可能發(fā)生變化，因而熒光強度將發(fā)生改變；對無機熒光物質(zhì)，因pH值會影響其穩(wěn)定性，因而也可使其熒光強度發(fā)生改變。影響熒光的外界因素（三）pH值：pH 13pH712苯胺苯胺在pH7-12溶液中會發(fā)生藍色熒光，在pH小于2或大于13的溶液中都不發(fā)生熒光。pH 13pH712苯胺苯胺在pH7-12溶影響熒光的外界因素（四）內(nèi)濾光和自吸： 體系內(nèi)存在可以吸收熒光的物質(zhì)，或熒光物質(zhì)的熒光短波長與激發(fā)光長波長

15、有重疊，均可使熒光強度下降，稱為內(nèi)濾光；當熒光物質(zhì)濃度較大時，可吸收自身的熒光發(fā)射稱為熒光自吸。影響熒光的外界因素（四）內(nèi)濾光和自吸：影響熒光的外界因素（五）熒光猝滅： 碰撞猝滅； 靜態(tài)猝滅； 轉(zhuǎn)入三重態(tài)的猝滅； 電子轉(zhuǎn)移猝滅； 自猝滅。影響熒光的外界因素（五）熒光猝滅：例：猝滅劑（quencher）的影響熒光猝滅：是指熒光物質(zhì)分子與溶劑或其它溶質(zhì)分子相互作用，引起熒光強度降低、消失或熒光強度與濃度不呈現(xiàn)線性關(guān)系的現(xiàn)象。 引起熒光猝滅的物質(zhì)，稱為猝滅劑，如鹵素離子、重金屬離子、氧分子、硝基化合物、重氮化合物、羰基化合物等吸電子極性物質(zhì)。熒光猝滅法: 有些猝滅劑的加入，其熒光強度的減少與熒光猝滅

16、劑的濃度呈線性關(guān)系，可用于測定猝滅劑的含量，這種方法稱為熒光猝滅法。例：猝滅劑（quencher）的影響熒光猝滅：是指熒光物質(zhì)分溶液的熒光一熒光分析的定量基礎(chǔ)熒光強度與溶液濃度的關(guān)系 F=F I0 Cb F 熒光效率 熒光物質(zhì)的摩爾吸光系數(shù) I0 激發(fā)光強度 b 液層厚度 F = KC（該式只有當 Cb 0.05時才成立）6.3熒光分析法溶液的熒光一熒光分析的定量基礎(chǔ)熒光強度與溶液濃度的關(guān)系6.2. 熒光分光光度計2. 熒光分光光度計單色器：選擇激發(fā)光波長的第一單色器和選擇發(fā)射光(測量)波長的第二單色器。光源：高壓汞燈、氙燈檢測器：光電倍增管2. 熒光分光光度計單色器單色器光源。檢測器液 槽放

17、大和指示儀表熒光分光光度計的結(jié)構(gòu)示意圖I0I單色器：選擇激發(fā)光波長的第一單色器和選擇發(fā)射光(測量)波長的激發(fā)光源 要求發(fā)射強度大,波長范圍寬,而且在整個波長范圍內(nèi)強度一致.常用高壓汞燈和氙弧燈.濾光片和分光器 干涉濾光片;分光器多采用光柵樣品室 樣品室由樣品池及樣品轉(zhuǎn)換器組成.其中樣品池用石英或低熒光的玻璃材料.激發(fā)光源發(fā)射單色器 用于選擇投射到檢測器的熒光波長。檢測器 熒光或磷光的強度較弱，要求檢測器靈敏度高。精密的熒光光度計采用光電倍增管為檢測器，將轉(zhuǎn)入的光信號轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘?，并將其放大，由記錄器記錄熒光強度。發(fā)射單色器6.3.2 熒光分析方法特點及應(yīng)用(一)熒光分析方法及特點1標準曲線法

18、用已知的標準物質(zhì)經(jīng)過和試樣同樣的處理后，配成一系列標液。測定標液的熒光強度，用熒光強度對標液濃度繪制標準曲線，然后根據(jù)試液的熒光強度，在標準曲線上求出試樣中熒光物質(zhì)的含量。6.3.2 熒光分析方法特點及應(yīng)用(一)熒光分析方法及特點2熒光分析法的靈敏度 比吸光法高得多，更適合于低濃度物質(zhì)的分子。 這兩種方法在靈敏度方面的差別主要是由于同濃度相關(guān)的參數(shù)的測量方式不同。2熒光分析法的靈敏度 而熒光強度F（或磷光強度P）直接同熒光（磷光）物質(zhì)的濃度成正比。同濃度相關(guān)的參數(shù)是在很小噪聲背景上的熒光（磷光）發(fā)射訊號本身，可用增強入射光強度I0或增大熒光訊號的放大倍數(shù)來提高靈敏度。而在光度法中, 若檢測器放

19、大倍數(shù) ，I0及I同時,A值不變。 故熒光法靈敏度常比相應(yīng)光度法高24個數(shù)量級。 而熒光強度F（或磷光強度P）直接同熒光（磷光） 在光度法中,表示方法的靈敏度。，其測定靈敏度。 在熒光法中，靈敏度與該物質(zhì)激發(fā)時的及發(fā)射時的量子效率有關(guān)。熒光法絕對靈敏度理論定義為的乘積（單位gcm-2 ）, ，熒光強度，測定靈敏度。熒光法絕對靈敏度實際定義為/H （H發(fā)射光譜半峰寬度m-1 ） 。 在光度法中,表示方法的靈敏度。，其測定 一般情況下，多采用相對靈敏度來表示。相對靈敏度是以喹啉硫酸氫鹽的0.05mol/L硫酸溶液為標準，并定為1，然后與相同濃度熒光物質(zhì)的熒光強度比較，可求該物質(zhì)的相對靈敏度。 一般

20、情況下，多采用相對靈敏度來表示。相對靈敏度幾種物質(zhì)的熒光絕對靈敏度 熒光物質(zhì)最大吸收波長/nm最大熒光波長/nm熒光光譜半寬度（H）m-1熒光靈敏度（最大吸收波長）喹啉硫酸氫鹽(0.05molL-1H2SO4)2504610.470.066羅丹明B（酒精）5445710.170.88熒光素（0.1molL-1NaOH4905150.201.0四溴熒光素（0.1molL-1NaOH5185400.180.19硫堇(0.05molL-1H2SO4)5986210.180.031幾種物質(zhì)的熒光絕對靈敏度 熒光物質(zhì)最大吸收波長最大熒光波長熒3. 熒光分析法的選擇性 很多分子在紫外可見區(qū)有吸收，但其中只

21、有一部分能再發(fā)射熒光或磷光，故熒光法固有干擾很少，選擇性較好。3. 熒光分析法的選擇性1.無機化合物 很多金屬（除鈾鹽等）和非金屬可同有機化合物形成熒光配合物，測量發(fā)射的熒光可定量分析。熒光法可測元素：Al、Au、B、Be、Ca、Cd、Cu、Eu、Ga、Gd、Ge、Hf、Mg、Nb、Pb、Rh、Ru、S、Se、Sb、Si、Sn、Ta、Tb、Th、Te、W、Zn和Zr等。還有一些無機離子如氟和氰離子等能使其它物質(zhì)的熒光由于熄滅效應(yīng)而減弱。據(jù)此可測氟和氰等離子的濃度。 (二)熒光分析法的應(yīng)用1.無機化合物 (二)熒光分析法的應(yīng)用無機離子的熒光測定法 離子試劑波長，nm靈敏度干擾激發(fā)熒光g/mLAl

22、3+茜素紫醬R4705000.007Be,Co,Cr,Cu,Th,Zr,F-,NO2-,Ni,PO43-F-鋁-茜素紫醬R(熒光熄滅)4705000.001Be,Co,Cr,Cu,Fe,Ni, Th,Zr, PO43-B4O72-安息香3704500.04Be,SbCd2+2-(鄰羥基苯)苯并惡唑365藍2NH3Li+8-羥基喹啉3705800.2MgSn4+黃酮醇4004700.1Fe,PO43-,ZrZn2+安息香綠10B,Be,Sb,無機離子的熒光測定法 離子試劑波長，nm靈敏度干擾激發(fā)熒光 2. 很多有機化合物可同無機陽離子形成熒光配合物，一般都具有苯環(huán)以及二個以上能同金屬離子螯合的配

23、位基團。下面是四種最常用的熒光試劑的結(jié)構(gòu)： 2. 很多有機化合物可同無機陽離子形成熒光配合物，一般都具 這些熒光試劑都具有電子系統(tǒng)。激發(fā)和發(fā)射過程同-*躍遷有關(guān)。這種躍遷常產(chǎn)生寬的無精細結(jié)構(gòu)的熒光峰。 熒光分光光度法解析課件3.3.生物分子:利用激發(fā)光譜和發(fā)射光譜用熒光法研究氨基酸和蛋白質(zhì)。雖然游離氨基酸中能產(chǎn)生熒光的只有幾個帶苯環(huán)的氨基酸如色氨酸、酪氨酸和苯基丙氨酸，然而，某些蛋白質(zhì)含有熒光輔酶(Fluorescent coenzyme)，熒光輔酶生色劑可用于許多蛋白質(zhì)的熒光分析中。 維生素B1(硫胺素)含量的測定 維生素B2(核黃素)含量的測定 維生素B11(葉酸)含量的測定3.3.生物分子:利用激發(fā)光譜和發(fā)射光譜用熒光法研究氨基酸和煙熏、烘烤、油炸等造成了3，4苯并芘含量的增加煙熏、烘烤、油炸等造成了3，4苯并芘含量的增加舉例 痕量3,4-苯并芘的測定: 苯并芘方法一：萃?。ōh(huán)己酮或石油醚）濃縮層析以H2SO4 溶解苯并芘熒光分析熒光測定：ex = 520 nmem= 545 nm舉例 痕量3,4-苯并芘的測定: 苯并芘方法一：熒光測定方法二：試樣先用有機