蛋白質(zhì)的修飾和表達(dá)03課件

1、第三章 蛋白質(zhì)的修飾和表達(dá)10/16/20221主要內(nèi)容第一節(jié) 蛋白質(zhì)修飾的化學(xué)途徑(P88-94 自學(xué))第二節(jié) 蛋白質(zhì)改造的分子生物學(xué)途徑第三節(jié) 重組蛋白質(zhì)的表達(dá)10/16/20222 第二節(jié) 蛋白質(zhì)改造的分子生物學(xué)途徑基因突變技術(shù)是通過(guò)在基因水平上對(duì)其編碼的蛋白質(zhì)分子進(jìn)行改造，在其表達(dá)后用來(lái)研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)功能的一種方法。分類(lèi)： 位點(diǎn)特異性突變基因突變技術(shù)（按特點(diǎn)劃分） 隨機(jī)突變 10/16/20223 1)通過(guò)寡核苷酸介導(dǎo)的基因突變位點(diǎn)特異性突變 2)盒式突變或片段取代突變 3)以雙鏈DNA為模板，利用PCR 技術(shù)進(jìn)行的基因突變可以這樣說(shuō)，PCR技術(shù)的出現(xiàn)為基因的突變，基因的剪接開(kāi)辟了一條

2、極其有效、極其快捷的道路。當(dāng)然無(wú)論哪種方法都可以在為蛋白質(zhì)編碼的基因序列上產(chǎn)生插入、缺失、取代等突變。10/16/20224 1編碼基因的專(zhuān)一性位點(diǎn)突變 定義：專(zhuān)一性位點(diǎn)突變又稱(chēng)特異性位點(diǎn)突變。這類(lèi)突變都是在含有突變序列的寡核苷引物介導(dǎo)下進(jìn)行的，因此又稱(chēng)為寡核苷酸介導(dǎo)的位點(diǎn)特異性突變。這種突變的方法從問(wèn)世至今不斷更新，特別是PCR技術(shù)出現(xiàn)后變得更高效。 (1) 寡核苷酸介導(dǎo)的基因突變中的各種因素 (2) 幾種寡核苷酸介導(dǎo)的基因突變方法 10/16/20225 核甘酸突變引物的設(shè)計(jì)和選擇必須與模板鏈上的目標(biāo)DNA序列有必要的互補(bǔ)區(qū)足夠長(zhǎng)，以便與目標(biāo)DNA序列退火突變引物應(yīng)盡可能避免形成穩(wěn)定的二級(jí)

3、結(jié)構(gòu)的回文序列、重復(fù)序列或自身互補(bǔ)序列突變引物要特異，不能與目標(biāo)DNA中突變位置以外的DNA形成非特異性的雜交混合體10/16/20227例子：將NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的MADS基因編碼蛋白質(zhì)的“KKACSDSSA”中的C（Cys）定點(diǎn)突變?yōu)锳（Arg）。10/16/2022810/16/20221010/16/20221110/16/202212DNA聚合酶的選擇T4DNA聚合酶T7DNA聚合酶Klenow酶 在單引物的延伸反應(yīng)中，避免使用不當(dāng)?shù)拿敢鹨镏脫Q，導(dǎo)致突變效率降低。10/16/202214dNTP（脫氧核苷三磷酸）對(duì)立體DNA合成的影響dNTP純度要高 dCTP氧化脫氨可以產(chǎn)生微量d

4、UTP，當(dāng)多核苷酸中攙入U(xiǎn)MP時(shí)，受體菌中的尿嘧啶-N-糖基化酶可在U的位置切斷DNA鏈，而細(xì)胞內(nèi)的DNA聚合酶能夠產(chǎn)生切口平移，從而降低突變體的產(chǎn)率。10/16/202215 (2) 幾種寡核苷酸介導(dǎo)的基因突變方法 Kunkel 突變法 基于抗生素抗性“回復(fù)”的突變方法 基于去除特定限制酶切位點(diǎn)的突變 利用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)產(chǎn)生定點(diǎn)突變10/16/202217 Kunkel 突變法Kunkel 1985年建立的方法：10/16/202218具體步驟：將待突變的基因克隆入M13 DNA載體上，導(dǎo)入具有dUTP酶（dut）和N-尿嘧啶脫糖苷酶（ung）雙缺陷的大腸桿菌（dut-，ung-）菌

5、株中。Dut缺陷導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)dUTP水平上升，并在DNA復(fù)制時(shí)，部分取代dTTP進(jìn)入DNA新生鏈中。又由于ung缺陷使摻入DNA的dUTP殘基不能除去。由這種大腸桿菌菌株產(chǎn)生的M13單鏈DNA大約有1%的T被U所取代，然后進(jìn)行DNA定點(diǎn)突變。雙鏈DNA導(dǎo)入正常的大腸桿菌中，其尿嘧啶N-糖基化酶除去DNA鏈上的尿嘧啶堿基。結(jié)果原來(lái)的M13模板鏈被降解，只有突變鏈因不含U，被保留下來(lái)。這種方法產(chǎn)生的M13噬菌體中含有突變DNA的比例大大增加。10/16/202219 基于抗生素抗性“回復(fù)”的突變方法10/16/202220 基于去除特定限制酶切位點(diǎn)的突變10/16/20222110/16/20222

6、2DNA片段的剪切10/16/202224取代突變10/16/202225缺失突變10/16/202227 2區(qū)域性定向突變 基因工程技術(shù)不但可使基因產(chǎn)生特異性位點(diǎn)突變，也可以產(chǎn)生區(qū)域性的突變。常用的方法如盒式突變法(cassette mutagenesis)，又稱(chēng)片段取代法(DNA fragment replacement)。這一方法的要點(diǎn)是利用目標(biāo)基因中所具有的適當(dāng)?shù)南拗菩詢(xún)?nèi)切酶位點(diǎn)，用具有任何長(zhǎng)度、任何序列(或任何混合序列)的DNA片段來(lái)置換或取代目標(biāo)基因上的一段DNA序列。10/16/202228研究目的 通過(guò)改變幾個(gè)氨基酸序列來(lái)研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)-功能之間的關(guān)系，也可以通過(guò)盒式突變法產(chǎn)

7、生嵌合蛋白質(zhì)。在這個(gè)嵌合蛋白質(zhì)中，蛋白質(zhì)分子中的整個(gè)結(jié)構(gòu)域都可以用完全不同的氨基酸序列來(lái)置換。 盒式突變最主要的用途是產(chǎn)生各種特異性的突變或突變家族，在這些突變體中各種不同的序列被集中在目標(biāo)基因的一個(gè)特定區(qū)域，從而為研究蛋白質(zhì)特定結(jié)構(gòu)區(qū)段或特定結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)和功能提供了一個(gè)切實(shí)可行的方法。10/16/202229二、基因融合和基因剪接1利用基因融合技術(shù)表達(dá)外源基因的緣由2基因融合的策略與蛋白質(zhì)分子嵌合體3蛋白質(zhì)內(nèi)含子介導(dǎo)的蛋白質(zhì)分子間的連接10/16/2022301利用基因融合技術(shù)表達(dá)外源基因的緣由外源蛋白通常易被宿主的蛋白水解酶降解通過(guò)與特異蛋白質(zhì)或特異的結(jié)構(gòu)域形成融合蛋白，利于快速回收、純化

8、融合蛋白可以體外切割去除融合部分，可以獲得天然蛋白通過(guò)與特定的蛋白質(zhì)形成融合蛋白，可以避免外源蛋白在細(xì)胞內(nèi)形成包涵體基因融合是對(duì)基因進(jìn)行改造的手段，廣泛用于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)功能的研究10/16/20223121 基因融合的策略將重組基因直接剪接于適當(dāng)?shù)男盘?hào)肽之后將外源基因本身按閱讀框架自我融合。對(duì)一些小肽的穩(wěn)定表達(dá)、表達(dá)產(chǎn)物的活性非常重要目標(biāo)蛋白在與其融合的蛋白伙伴序列的C端或N端融合10/16/202232分泌親和融合。即：信號(hào)肽融合蛋白目標(biāo)基因雙親和融合法。即將目標(biāo)基因與兩個(gè)不同配基有特異親和的異源或載體蛋白融合分泌插入融合法。此法是將目標(biāo)基因插入到信號(hào)肽序列和一插入序列之間，此插入序列是一種插

9、入到細(xì)胞膜或細(xì)胞壁的蛋白編碼 設(shè)計(jì)目的：用以將受體或抗原定位于細(xì)胞的外表面或裝配成融合蛋白進(jìn)入類(lèi)病毒顆粒，利于開(kāi)發(fā)疫苗，或產(chǎn)生具有免疫原的復(fù)合物21 基因融合的策略10/16/2022332.2 產(chǎn)生蛋白質(zhì)分子嵌合體的策略通過(guò)限制性?xún)?nèi)切酶位點(diǎn)連接 條件：兩個(gè)蛋白質(zhì)之間有相同的限制性?xún)?nèi)切酶位點(diǎn)通過(guò)缺失突變的方法連接 條件：兩個(gè)蛋白質(zhì)之間有相同的額外的堿基序列通過(guò)PCR雙側(cè)重疊延伸法 該法可以在不需要分子間具有相容的限制性?xún)?nèi)切酶位點(diǎn)，將兩個(gè)編碼不同蛋白質(zhì)的DNA分子重組，形成DNA分子嵌合體10/16/20223410/16/2022353蛋白質(zhì)內(nèi)含子介導(dǎo)的蛋白質(zhì)分子間的連接1990年Saccha

10、romydes cerevisiae發(fā)現(xiàn)在腺苷三磷酸核苷酸酶中蛋白質(zhì)會(huì)發(fā)生自我剪接（protein splicing），從而首次發(fā)現(xiàn)第一個(gè)蛋白質(zhì)內(nèi)含子Sce VMA 蛋白質(zhì)內(nèi)含子(intein)是蛋白質(zhì)中的一段多肽鏈, 它靠自我剪切的方式從前體蛋白中分離出來(lái), 而兩端的外顯子以肽鍵的方式相連 10/16/202236基因融合的用途上述這些基因融合策略，主要是有利于：外源基因的表達(dá)表達(dá)產(chǎn)物的分離純化以及細(xì)胞定位 作為蛋白質(zhì)分子改造可以借用這些策略對(duì)蛋白質(zhì)分子中的特定序列、結(jié)構(gòu)元件乃至結(jié)構(gòu)域通過(guò)基因剪接來(lái)進(jìn)行操作。10/16/202237 第三節(jié) 重組蛋白質(zhì)的表達(dá)重組蛋白質(zhì)在大腸桿菌中的表達(dá)重組蛋

11、白質(zhì)在酵母細(xì)胞中的表達(dá)重組蛋白質(zhì)在哺乳類(lèi)動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)10/16/202238 一、大腸桿菌中表達(dá)體系的優(yōu)點(diǎn)大腸桿菌(E.coli)表達(dá)體系是目前應(yīng)用最廣的一個(gè)外源基因表達(dá)體系，是外源基因表達(dá)的首選體系。利用大腸桿菌作為表達(dá)體系的優(yōu)點(diǎn)：1）遺傳學(xué)和生理學(xué)背景清楚；2）容易培養(yǎng)，特別是高密度發(fā)酵；3）外源基因經(jīng)?？梢赃_(dá)到高效表達(dá)。10/16/202239大腸桿菌表達(dá)體系的缺點(diǎn)大腸桿菌系統(tǒng)最大的不足之處是：（1）不能進(jìn)行典型真核細(xì)胞所具有的復(fù)雜的翻譯后修飾，如糖基化、烷基化、磷酸化、特異性的蛋白水解加工等；（2）廣泛二硫鍵的形成以及外源蛋白質(zhì)組裝成多亞基復(fù)合體的能力也受到限制。（3）外源基因產(chǎn)物

12、在大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)易形成不溶性的包涵體； （4）而當(dāng)真核基因在大腸桿菌中表達(dá)時(shí)，作為起始氨基酸，甲硫氨酸常依然保留在蛋白質(zhì)的N末端。最后，由于真核mRNA的結(jié)構(gòu)特性以及密碼子使用頻率與大腸桿菌本身的差異，當(dāng)用真核mRNA的序列直接在大腸桿菌細(xì)胞中表達(dá)時(shí)，（5）有時(shí)不能得到足夠的產(chǎn)物。10/16/202240大腸桿菌表達(dá)體系的應(yīng)用 當(dāng)外源蛋白質(zhì)的分子量小于70kD,不存在半胱氨酸或分子內(nèi)的二硫鍵少于34個(gè)，以及不需要翻譯后修飾而能保持其生物活性的蛋白質(zhì)，大多可以利用大腸桿菌系統(tǒng)得到滿(mǎn)意的結(jié)果。10/16/2022411表達(dá)載體的一般特點(diǎn)(1) 復(fù)制起始點(diǎn)(2) 選擇性基因 (3) 強(qiáng)的、可誘導(dǎo)的啟

13、動(dòng)子(4) 強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄終止序列 (5) 核糖體結(jié)合位點(diǎn)(6) 合適的多克隆位點(diǎn)10/16/202242(1) 復(fù)制起始點(diǎn)絕大多數(shù)載體利用pBR322或pUC質(zhì)粒來(lái)源的復(fù)制起始點(diǎn)（如，pET28系列）復(fù)制起始點(diǎn)決定了細(xì)胞內(nèi)質(zhì)粒的拷貝數(shù)pBR322或pUC質(zhì)粒來(lái)源的質(zhì)粒可保持2050個(gè)拷貝數(shù)和150200個(gè)拷貝數(shù)10/16/202243(2) 選擇性基因 載體上要含有至少一個(gè)選擇性基因作用： 1）保證對(duì)轉(zhuǎn)化體的篩選 2）保證在培養(yǎng)過(guò)程中受體細(xì)胞質(zhì)粒不丟失種類(lèi)：10/16/202244(3) 強(qiáng)的、可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子原核細(xì)胞的啟動(dòng)子包括了RNA聚合酶的識(shí)別位點(diǎn)和結(jié)合位點(diǎn)啟動(dòng)子序列通常包含了10區(qū)（TATA

14、AT）和35區(qū)（TTGACA）常用的種類(lèi)：LacUV5、trp、tac、trc以及T7啟動(dòng)子RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)RNA聚合酶識(shí)別位點(diǎn)10/16/202245(4) 強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄終止序列 為使目標(biāo)基因有效的轉(zhuǎn)錄，需要滿(mǎn)足兩個(gè)條件：轉(zhuǎn)錄終止序列抗轉(zhuǎn)錄終止序列 減少不必需的轉(zhuǎn)錄通過(guò)復(fù)制起始位點(diǎn)，其作用可以幫助穩(wěn)定mRNA，增加mRNA的半衰期 保證目標(biāo)基因完全被轉(zhuǎn)錄10/16/202246(5) 核糖體結(jié)合位點(diǎn)位置：位于啟動(dòng)子下游，翻譯起始密碼ATG的上游核糖體結(jié)合位點(diǎn)SD序列，對(duì)原核細(xì)胞mRNA翻譯起始非常關(guān)鍵10/16/202247(6) 合適的多克隆位點(diǎn)將目標(biāo)基因插入到表達(dá)載體上用于構(gòu)建或改造載體

15、10/16/2022482與外源基因有效表達(dá)的相關(guān)因素(1) 有效的轉(zhuǎn)錄起始(2) 有效的翻譯(3) 蛋白質(zhì)水解作用(4) 蛋白質(zhì)的外泌 10/16/202249(1) 有效的轉(zhuǎn)錄起始轉(zhuǎn)錄起始的速率是基因表達(dá)的主要限速步驟高效表達(dá)的載體包含： 1）啟動(dòng)子的強(qiáng)弱 2）調(diào)控序列10/16/202250(2) 有效的翻譯mRNA的穩(wěn)定性翻譯起始的頻率肽鏈延伸 和終止的速率翻譯的忠實(shí)性mRNA轉(zhuǎn)錄速率越高mRNA降解速率越低高核糖體結(jié)合位點(diǎn)（SD序列）SD序列與起始密碼之間的距離起始密碼上游區(qū)的序列SD序列與可翻譯序列5端形成的二級(jí)結(jié)構(gòu)遺傳密碼的使用（高頻或低頻）等多加入終止密碼子（串聯(lián)終止子）錯(cuò)誤氨

16、基酸的攙入10/16/202251(3) 蛋白質(zhì)水解作用合成后的蛋白質(zhì)在各種蛋白酶和肽酶作用下加工特異蛋白水解加工：主要有兩種類(lèi)型，一類(lèi)是信號(hào)肽酶I（Lep）或信號(hào)肽酶II（Lsp）將分泌（或外運(yùn)）蛋白質(zhì)上的信號(hào)肽切除；一類(lèi)是對(duì)存在于N末端的甲硫氨酸進(jìn)行加工蛋白質(zhì)的降解 大腸桿菌內(nèi)不同的蛋白水解酶和肽酶10/16/202252(4) 蛋白質(zhì)的外泌外源蛋白質(zhì)與細(xì)菌細(xì)胞的外泌系統(tǒng)相容，可以穿過(guò)細(xì)胞質(zhì)膜進(jìn)入周質(zhì)，這一過(guò)程稱(chēng)為外泌（export）分泌（secretion）是指蛋白產(chǎn)物被外運(yùn)到細(xì)胞之外蛋白質(zhì)外泌的優(yōu)點(diǎn)：格蘭氏陰性菌的周質(zhì)中的內(nèi)環(huán)境比細(xì)胞周質(zhì)內(nèi)氧化性要強(qiáng)，利于含二硫鍵蛋白質(zhì)的正確折疊從細(xì)胞

17、質(zhì)中外運(yùn)到周質(zhì)中克服了毒性蛋白質(zhì)對(duì)細(xì)胞的損害，如水解酶和DNA結(jié)合蛋白通過(guò)信號(hào)肽酶加工，使外源蛋白有正確的N端蛋白的外泌，特別是分泌到培養(yǎng)基中，便于純化10/16/202253 3改善表達(dá)水平的方法 誘導(dǎo)條件外源基因的編碼序列用蛋白酶缺失的宿主菌10/16/202254誘導(dǎo)條件誘導(dǎo)時(shí)間（常用）誘導(dǎo)溫度（常用）培養(yǎng)基組成10/16/202255外源基因的編碼序列利用密碼簡(jiǎn)并原理，改變編碼區(qū)的核甘酸序列而不改變氨基酸序列，使目標(biāo)基因的前幾個(gè)密碼子中的G/C變?yōu)锳/T用優(yōu)先使用的密碼子代替罕用密碼子通過(guò)改變核甘酸序列減少翻譯起始區(qū)mRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)利用高表達(dá)識(shí)別罕用密碼的tRNA質(zhì)粒盡量避免使用那些

18、可能引起翻譯問(wèn)題的密碼子10/16/202256用蛋白酶缺失的宿主菌避免細(xì)胞內(nèi)的蛋白酶分解產(chǎn)生的蛋白質(zhì)10/16/2022574. 改善外源蛋白溶解性的方法 外源蛋白的分泌表達(dá) 細(xì)菌生長(zhǎng)溫度 外源蛋白與分子伴侶和折疊酶共表達(dá) 外源蛋白與相關(guān)蛋白或蛋白標(biāo)簽融合10/16/202258 三、重組蛋白質(zhì)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá) 1選擇哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)體系的優(yōu)點(diǎn)2兩個(gè)主要的哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)10/16/2022591哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)體系的優(yōu)點(diǎn)哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)體系的種類(lèi)和數(shù)目已經(jīng)發(fā)展很快。哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)體系有很多其他體系不能與之相比的優(yōu)勢(shì)。它具有復(fù)雜的翻譯后加工系統(tǒng)，糖基化以及二硫鍵在合成和分泌過(guò)程中自然而然的正確形成。哺乳動(dòng)物細(xì)胞具有產(chǎn)生正確折疊和完全生物活性的蛋白質(zhì)。實(shí)例：組織血纖維蛋白溶酶原激活因子(tPA)、紅細(xì)胞生成素(EPO)、人DNA酶。在大腸桿菌中表達(dá)tPA時(shí)，產(chǎn)生錯(cuò)折疊和非糖基化，而在酵母中表達(dá)tPA產(chǎn)生過(guò)糖基化，二者的產(chǎn)物都沒(méi)有生物活性。10/16/202260分泌型哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng) 哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)可以通過(guò)設(shè)計(jì)，使外源重組蛋白直接分泌到培養(yǎng)基中。這個(gè)重組表達(dá)單位包括N末端的信號(hào)肽，其作用使起始新生肽鏈插入到內(nèi)織網(wǎng)中，此信號(hào)肽在分泌過(guò)程中被切除，從